普通肝素對(duì)膿毒癥小鼠的治療作用及其機(jī)制研究-炎癥和凝血反應(yīng)、肺組織Rho激酶.pdf

1、嚴(yán)重感染和感染性休克的病死率高,全身炎癥反應(yīng)與凝血系統(tǒng)的激活是其重要的發(fā)病機(jī)制。在革蘭氏陰性桿菌所致的內(nèi)毒素血癥,脂多糖誘導(dǎo)單核細(xì)胞表達(dá)多種促炎因子:包括腫瘤壞死因子-α、白介素1、白介素6等。大量的研究證實(shí),嚴(yán)重感染的患者機(jī)體的炎癥反應(yīng)促進(jìn)凝血系統(tǒng)的激活,導(dǎo)致微循環(huán)微血栓的形成,造成多器官功能衰竭。
　　 作為一種抗凝劑,普通肝素同時(shí)也具有抗炎作用。以往的一些有關(guān)內(nèi)毒素或者病原微生物誘導(dǎo)的膿毒癥模型研究顯示普通肝素對(duì)于膿毒癥治

2、療具有潛在價(jià)值,能夠降低凝血系統(tǒng)的激活,提高生存率。但也有一些研究并未顯示出肝素的益處。
　　 本研究的目的之一就是觀察肝素對(duì)于脂多糖誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠炎癥和凝血反應(yīng)的影響,觀察肝素能否保護(hù)臟器功能、改善預(yù)后。
　　 Rho屬于胞內(nèi)小型G蛋白家族成員,當(dāng)其與GTP結(jié)合時(shí)具有激酶活性。Rho激酶(ROCK)是Rho的效應(yīng)分子之一,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)人體中有兩種Rho激酶同工酶,分別由ROCK1和ROCK2基因編碼,這兩個(gè)基因廣泛表達(dá)于

3、各類組織細(xì)胞。Rho激酶在細(xì)胞內(nèi)也行使著許多重要的功能,其中包括肌動(dòng)蛋白骨架的形成、細(xì)胞的遷移、黏附以及調(diào)控氧自由基、促炎因子和趨化因子的生成等。Rho激酶的活性在應(yīng)用LPS后立即增加,并在24小時(shí)達(dá)到高峰,從而提示其在內(nèi)毒素血癥中扮演著重要角色。一些研究表明,ROCK在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肺損傷發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用,抑制其活性能夠緩解內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞骨架的重排,降低中性粒細(xì)胞向肺實(shí)質(zhì)的遷移。
　　 在這項(xiàng)研究中,我們應(yīng)用內(nèi)毒素小鼠模型,

4、試圖探討ROCK在LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和肺損傷中的作用。同時(shí)為了研究普通肝素對(duì)膿毒癥小鼠肺損傷保護(hù)作用的機(jī)制,我們觀察了肝素對(duì)肺組織ROCK基因和活性的影響。
　　 方法1：C57BL/6J小鼠隨機(jī)分成三組:正常對(duì)照、LPS和LPS+UFH組。LPS+UFH組的小鼠經(jīng)尾靜脈注射8units/20g體重、溶解于20μ1無(wú)菌生理鹽水的普通肝素,其余各組只注射相同體積的生理鹽水。應(yīng)用肝素后半小時(shí)腹腔注射LPS(30mg/kg)。LPS

5、后3.6和/或12小時(shí)留取靜脈血、肝、肺組織標(biāo)本待檢。生存率的研究是在LPS后1,12,24和36小時(shí)分別予以上述劑量的肝素治療。每12小時(shí)觀察生存情況,直至72小時(shí)。
　　 方法2：C57BL/6J小鼠隨機(jī)分成三組:正常對(duì)照、LPS和LPS+fasudil組。內(nèi)毒素小鼠模型同上。Rho激酶抑制劑法舒地爾(10mg/kg)溶解于生理鹽水(1μL/gbodyweight),在LPS前18和1小時(shí)腹腔注射。其余兩組應(yīng)用相同容積生理鹽

6、水。LPS后3和/或6小時(shí)留取血和肺組織待檢。
　　 結(jié)果1：1)普通肝素預(yù)處理可以降低3和6小時(shí)血漿TNF-α,IL-1β和TAT的含量;2)普通肝素預(yù)處理可以下調(diào)3小時(shí)血細(xì)胞中TNF-α,IL-1β和組織因子基因的表達(dá);3)普通肝素預(yù)處理可以顯著減少肝臟中性粒細(xì)胞的聚集(3和6小時(shí))、纖維蛋白(原)的沉積。4)普通肝素預(yù)處理可以明顯降低6小時(shí)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶和血肌酐的含量,而且能夠緩解肺損傷的程度。5)普通肝素預(yù)處理可以顯著降

7、低膿毒癥小鼠肺組織中Rho激酶的活性(3和6小時(shí));6)普通肝素預(yù)處理可以抑制膿毒癥小鼠肺組織ROCK1(6,12小時(shí))和ROCK2(12小時(shí))基因的表達(dá)。7)普通肝素治療能夠降低內(nèi)毒素血癥小鼠的死亡率。
　　 結(jié)果2：1)法舒地爾預(yù)處理可以降低LPS誘導(dǎo)的血清TNF-α、IL-1β濃度以及肺組織髓過氧化物酶(MPO)的活性,而且法舒地爾可以緩解LPS誘導(dǎo)的肺損傷。2)法舒地爾預(yù)處理能夠抑制LPS誘導(dǎo)的血細(xì)胞TNF-α和IL-1