肝素對(duì)膿毒癥小鼠肺血管通透性影響的研究.pdf

1、膿毒癥是導(dǎo)致危重病患者死亡的主要原因。微血栓形成傾向及凝血和炎癥之間的交叉對(duì)話是膿毒癥的重要病理生理特征。膿毒癥主要的臨床表現(xiàn)并不是有入侵的微生物直接引起的，而是全身炎癥反應(yīng)失衡導(dǎo)致的低血壓，凝血和多器官功能障礙綜合征。眾所周知，在膿毒癥中全身炎癥反應(yīng)失衡引起凝血系統(tǒng)激活，抗凝機(jī)制抑制和纖溶系統(tǒng)激活。凝血的激活和纖維蛋白沉積是宿主阻止微生物入侵的主要防御手段，并引起以后的炎癥反應(yīng)。然而過度的反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致凝血本身引起的疾病，微血栓的形成和器

2、官功能衰竭，甚至DIC。
　　 急性肺損傷(ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的病理生理過程與膿毒癥很相似，都包括宿主失控的防御反應(yīng)引起炎癥、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、促凝活性加強(qiáng)、纖溶活性下降和纖維蛋白沉積。放大的促凝活性和纖溶抑制是膿毒癥的病理生理特征，與ARDS相似。在ALI時(shí)活化的TF/Ⅶa促發(fā)了肺的促凝活性，結(jié)果凝血酶大量產(chǎn)生、纖維蛋白沉積。肺泡和間質(zhì)纖維蛋白沉積是ALI早期的標(biāo)志性病理生理改變。因此在膿毒癥及其引起的肺損傷

3、中需要使用抗凝治療減輕組織缺氧和減少器官損傷和功能障礙。
　　 本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，研究肝素對(duì)膿毒癥小鼠急性肺損傷和肺血管通透性的影響，探討肝素對(duì)膿毒癥急性肺損傷的治療作用以及作用機(jī)制，探討肝素對(duì)膿毒癥血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，尤其肺血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響及其機(jī)制，為肝素用于臨床膿毒癥患者的救治提供依據(jù)。
　　 材料與方法:
　　 觀察肝素對(duì)膿毒癥小鼠急性肺損傷、肺血管通透性、肺組織SRC及死亡率的影響。觀察

4、肝素對(duì)膿毒癥小鼠血清血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷標(biāo)志物(sTM、sEPCR)、活化蛋白C和肺組織NF-κB、P38MAPK的影響。觀察膿毒癥小鼠血清對(duì)體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞通透性以及內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和骨架的影響。
　　 一、研究肝素對(duì)腹腔注射內(nèi)毒素(LPS)致膿毒癥小鼠炎癥反應(yīng)、肺損傷和生存率的影響，并探討肝素的作用機(jī)制。方法1.將36只C57BL/6J雄性小鼠平均隨機(jī)分成3組，即對(duì)照組(A組)、內(nèi)毒素組(B組)和內(nèi)毒素+肝素組(C組)。靜

5、脈注射內(nèi)毒素后3、6、12小時(shí)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組取4只采血，處死小鼠、取肺組織。肺組織做病理光鏡觀察。應(yīng)用ELISA法測(cè)定血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)和肺組織髓過氧化物酶(MPO)濃度。應(yīng)用RT-PCR的方法測(cè)定肺組織TNF-α、IL-1β表達(dá)。應(yīng)用Western-Blot的方法測(cè)定肺組織Src家族激酶(SFKs)中SRC和P-SRC含量。2.將12只C57BL/6J雄性小鼠平均隨機(jī)分成3組，即對(duì)照組(A組

6、)、內(nèi)毒素組(B組)和內(nèi)毒素+肝素組(C組)。腹腔注射內(nèi)毒素后3小時(shí)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組取4只尾靜脈注射伊文思藍(lán)，取肺組織測(cè)干濕重及伊文思藍(lán)含量。3.將40只C57BL/6J雄性小鼠平均隨機(jī)分成2組，即內(nèi)毒素組和內(nèi)毒素+肝素組。觀察小鼠96 h內(nèi)的一般狀態(tài)和存活情況。
　　 二、觀察肝素對(duì)膿毒癥小鼠內(nèi)皮細(xì)胞損傷標(biāo)志物(血清sTM、sEPCR)、血清活化蛋白C和肺、肝組織NF-κB、P38MAPK含量的影響。方法1.將36只C57BL/

7、6J雄性小鼠隨機(jī)分成3組，即對(duì)照組(A組)12只、內(nèi)毒素組(B組)12只、內(nèi)毒素+肝素組(C組)12只。腹腔注射內(nèi)毒素后3、6、12小時(shí)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組取4只采血，處死小鼠。6小時(shí)時(shí)間點(diǎn)取肺、肝、腎標(biāo)本。肺組織、肝臟、腎臟組織做病理光鏡觀察。應(yīng)用ELISA法測(cè)定血清APC、sEPCR、sTM濃度。應(yīng)用Western-Blot的方法測(cè)定肺、肝組織NF-κB、P38MAPK含量。
　　 三、研究膿毒癥小鼠血清對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUV

8、ECs)單層通透性和細(xì)胞骨架形態(tài)的影響以及肝素對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的作用。方法：1.留取血清：將36只C57BL/6J雄性小鼠隨機(jī)分成3組，即對(duì)照組(A組)12只、內(nèi)毒素組(B組)12只、內(nèi)毒素+肝素組(C組)12只。腹腔注射內(nèi)毒素后6小時(shí)采血。2.應(yīng)用ELISA法測(cè)定血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白(sTM)、可溶性內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體(sEPCR)濃度。3.HUVECs細(xì)胞株傳代培養(yǎng)后隨機(jī)分3組

9、(n=5)，分別加入方法1留取的3組血清培養(yǎng)。用transwell小室法測(cè)定單層內(nèi)皮細(xì)胞通透性；用免疫熒光染色法測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞纖維狀肌動(dòng)蛋白(F-actin)形態(tài)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 一、1.內(nèi)毒素組和內(nèi)毒素+肝素組3、6、12h的血漿TNF-α和IL-1β含量均顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)。與內(nèi)毒素組比較，內(nèi)毒素+肝素組3、6、12h的血清TNF-α和IL-1β含量均有顯著降低(P<0.05)。2.C組較B組

10、光鏡下肺組織損傷程度減輕。3.內(nèi)毒素組和內(nèi)毒素+肝素組3、6、12h的肺組織干濕重比顯著低于正常對(duì)照組(P<0.05)、伊文思藍(lán)含量均顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)。與內(nèi)毒素組比較，內(nèi)毒素+肝素組3、6、12h的肺組織干濕重比顯著高于內(nèi)毒素組(P<0.05)、伊文思藍(lán)含量顯著低于內(nèi)毒素組(P<0.05)。4.內(nèi)毒素組和內(nèi)毒素+肝素組3、6、12h的肺組織SRC和P-SRC含量均顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)。與內(nèi)毒素組比較，內(nèi)毒

11、素+肝素組3、6、12h的肺組織P-SRC含量有顯著降低(P<0.05)。4.內(nèi)毒素+肝素組小鼠較內(nèi)毒素組癥狀輕，中位生存時(shí)間延長(zhǎng)，生存率提高(P<0.05)。
　　 二、1.內(nèi)毒素組和內(nèi)毒素+肝素組3、6、12h的血清sTM、sEPCR含量均顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)。與內(nèi)毒素組比較，內(nèi)毒素+肝素組3、6、12h的血清sTM、sEPCR含量均有顯著降低(P<0.05)。2.內(nèi)毒素組和內(nèi)毒素+肝素組3、6、12h的血清活

12、化蛋白C含量顯著低于正常對(duì)照組(P<0.05)。與內(nèi)毒素組比較，內(nèi)毒素+肝素組3、6、12h的血清活化蛋白C含量有顯著升高(P<0.05)。3.C組較B組光鏡下肺、肝、腎組織損傷程度減輕。4.內(nèi)毒素組和內(nèi)毒素+肝素組3h的肝、肺組織NF-κB、P38MAPK含量均顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)。與內(nèi)毒素組比較，內(nèi)毒素+肝素組3h的肝、肺組織NF-κB、P38MAPK含量均有顯著降低(P<0.05)。
　　 三、1.B組和C組

13、較A組的內(nèi)皮細(xì)胞通透性明顯增加，C組較B組的內(nèi)皮細(xì)胞通透性明顯下降。2.A組內(nèi)皮細(xì)胞骨架和形態(tài)無明顯異常，B組血清孵育后，外周致密帶邊緣變得毛糙不規(guī)則，逐漸出現(xiàn)鋸齒樣斷裂，并形成非極性排列的應(yīng)力纖維。在C組血清孵育后的內(nèi)皮細(xì)胞，F(xiàn)-actin分布較均勻，細(xì)胞外周致密帶邊緣較規(guī)整，在細(xì)胞周邊偶有應(yīng)力纖維的形成。
　　 結(jié)論：
　　 一、肝素可以減輕膿毒癥小鼠的炎癥反應(yīng)和急性肺損傷，減少肺血管通透性，并顯著提高生存率，可能與