縫隙連接蛋白40與肺血管通透性的相關(guān)性研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:觀察縫隙連接蛋白40(connexin40,Cx40)以及參與維持血管屏障完整性的血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣黏蛋白( vascular endothelial cadherin, VE-cadherin)在C57BL/6小鼠急性肺損傷模型不同時期的表達(dá)變化情況,并探究Cx40與肺血管通透性的功能相關(guān)性。
  方法:C57BL/6小鼠腹腔注射內(nèi)毒素脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),以腹腔注射生理鹽水為對照組,24小時

2、后,分別行離體肺灌注,平穩(wěn)灌注后將左心房壓提高10cmH2O,檢測其肺重量變化情況以確保內(nèi)毒素引起急性肺損傷模型的可靠性,進(jìn)而采用蛋白免疫印跡的方法檢測腹腔注射LPS后6小時、24小時、3天后Cx40和VE-cadherin蛋白表達(dá)情況,以未處理組為空白對照;為研究Cx40與肺血管通透性的功能相關(guān)性,在C57BL/6小鼠離體肺灌注系統(tǒng)中使用血小板激活因子(platelet-activating factor,PAF)建立急性肺水腫模型,

3、運(yùn)用Cx40特異抑制模擬肽gap2740以及非選擇性縫隙連接抑制劑甘珀酸(carbenoxolone)進(jìn)行干預(yù),通過離體肺灌注系統(tǒng)檢測gap2740以及甘珀酸對PAF效果的影響,初步確定Cx40與肺血管通透性的功能相關(guān)性;使用凝血酶(thrombin)處理人肺血管內(nèi)皮細(xì)胞建立內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能破壞(即通透性增高)模型作為對照,運(yùn)用甘珀酸進(jìn)行干預(yù),經(jīng)ECIS(Electric Cell-Substrate Impedance Sensing

4、)檢測縫隙連接與肺血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的關(guān)系;為進(jìn)一步探究敲除Cx40基因?qū)Ψ窝芡ㄍ感缘挠绊?,通過離體肺灌注系統(tǒng)觀察PAF對Cx40基因敲除C57BL/6小鼠的影響,記錄肺重量變化情況,以使用PAF處理正常C57BL/6小鼠為對照
  結(jié)果:腔注射LPS24小時后其肺重量升高的程度明顯高于生理鹽水對照組,腹腔注射LPS可有效建立急性肺損傷模型,蛋白免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn),Cx40蛋白表達(dá)在腹腔注射LPS6小時后明顯低于空白對照組,至24

5、小時其蛋白表達(dá)水平繼續(xù)降低,第3天Cx40蛋白表達(dá)相較于第24小時的表達(dá)有所回升, VE-cadherin的蛋白表達(dá)水平變化與Cx40一致;C57BL/6小鼠離體肺灌注實(shí)驗(yàn)中,PAF在短時間內(nèi)就可以引起肺重量急劇升高,導(dǎo)致強(qiáng)烈的肺水腫,而gap2740和甘珀酸均可以顯著緩解PAF致肺水腫效應(yīng),gap2740和甘珀酸的作用相當(dāng);經(jīng)ECIS檢測發(fā)現(xiàn),凝血酶可以明顯降低人肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的電阻抗,提示人肺血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加,而甘珀酸可以顯著

6、緩解凝血酶的作用;在Cx40基因敲除C57BL/6小鼠離體肺灌注實(shí)驗(yàn)中,相較于正常C57BL/6小鼠,PAF引起Cx40基因敲除C57BL/6小鼠發(fā)生急性肺水腫的作用明顯降低。
  結(jié)論:在內(nèi)毒素引起的相對慢性肺損傷過程中, Cx40與VE-cadherin表達(dá)水平逐漸降低,并伴隨著血管通透性的增高;兩者表達(dá)水平在損傷和修復(fù)階段不斷發(fā)生變化,其變化情況一致。而在PAF以及凝血酶引起的相對急性肺損傷過程中,抑制Cx40以及縫隙連接可

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