缺氧誘導因子1α對失血性休克血管舒張反應性的調控作用及與肌內皮縫隙連接蛋白的關系.pdf

1、嚴重創(chuàng)傷/休克失代償期常出現(xiàn)血管的低反應性,它表現(xiàn)為全身血管對縮血管物質和舒血管物質的反應降低或不反應,導致血壓不能有效提升、組織灌注難以改善,細胞缺氧和損傷進行性加重。研究發(fā)現(xiàn)血管低反應性的發(fā)生與腎上腺素能受體失敏、一氧化氮(nitric oxide,NO)水平增高、血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)鉀、鈣通道功能失常及細胞膜超極化有關。此外,本實驗室的前期研究也發(fā)現(xiàn):休克后,VSMC存

2、在鈣失敏,VSMC鈣失敏在休克后血管低反應性的發(fā)生中起重要作用。
　　 HIF-1α是缺氧誘導因子家族優(yōu)勢亞型HIF-1的活性亞基。通過與其調控基因的增加子序列結合,HIF-1廣泛參與了哺乳動物細胞對低氧的特異性應答,在缺氧誘導的基因表達調節(jié)中起到了關鍵性的作用,其下游調節(jié)基因作用包括紅細胞生成、細胞能量代謝、離子代謝、血管舒縮反應、血管生成、細胞周期調控等。
　　 本實驗室前期研究證實,在失血性休克后,HIF-1α在血

3、管收縮反應性的調節(jié)中有重要的作用,其機制是:HIF-1α通過調控eNOS、iNOS、HO-1、COX-2、ET-1等下游的基因,調節(jié)血管活性物質釋放而調節(jié)血管收縮反應性。但HIF-1α是否參與休克后血管舒張反應性的調節(jié),其調節(jié)機制如何,是否與MEGJ有關國內外尚未見報道,需要研究闡明。
　　 為此,本實驗利用SD大鼠失血性休克模型和離體缺氧培養(yǎng)血管環(huán),研究了HIF-1α對失血性休克后血管舒張反應性的調控作用以及與MEGJ的關系。

4、具體內容包括:(1)HIF-1α對失血性休克血管舒張反應性的調節(jié)作用:(2)HIF-1α對缺血缺氧血管舒張反應性的調節(jié)作用與MEGJ的關系;(3)HIF-1α對失血性休克血管鈣敏感性的調節(jié)作用。
　　 主要實驗方法:
　　 第一部分 HIF-1α對失血性休克血管舒張反應性的調節(jié)作用
　　 實驗以失血性休克SD大鼠腸系膜上動脈(superior mesenteric artery,SMA)為研究對象,觀察HIF-1

5、α特異性抑制劑寡霉素(oligomycin)處理前后,休克大鼠SMA(休克即刻,休克0.5h,休克1h,休克2h,休克3h,休克4h)對非內皮依賴的血管舒張劑硝普鈉(sodium nitroprusside,SNP)和內皮依賴的舒張劑乙酰膽堿(acetylcholine,Ach)的反應性變化情況。同時測定不同程度休克血管中HIF-1α mRNA的表達變化。
　　 第二部分 HIF-1α對缺血缺氧血管舒張反應性的調節(jié)作用與MEGJ

6、的關系
　　 實驗取正常大鼠SMA血管環(huán),通過缺氧和營養(yǎng)剝奪培養(yǎng)模擬失血性休克體內缺血缺氧環(huán)境(缺氧即刻,缺氧0.5h,缺氧1h,缺氧2h,缺氧3h,缺氧4h),觀察寡霉素處理前后缺血缺氧處理血管環(huán)對Ach的舒張反應性變化規(guī)律;觀察使用反義寡核苷酸阻斷MEGJ后的血管環(huán)對Ach的舒張反應性變化規(guī)律。分別使用銀杏葉提取物EGb761(商品名:金納多)和寡霉素誘導和阻斷HIF-1α的表達,測定Cx40、Cx43 mRNA的表達變化。

7、用免疫共沉淀技術檢測HIF-1α與Cx40、Cx43有無直接結合活性。
　　 第三部分 HIF-1α對失血性休克血管鈣敏感性的調節(jié)作用
　　 實驗以失血性休克SD大鼠腸系膜上動脈(superior mesenteric artery,SMA)為研究對象,觀察HIF-1α特異性抑制劑寡霉素(oligomycin)處理前后,休克大鼠SMA(休克即刻,休克0.5h,休克1h,休克2h,休克3h,休克4h)的鈣敏感性變化情況。同

8、時測定不同程度休克血管中MLC20磷酸化水平的變化情況。
　　 主要研究成果:
　　 1.HIF-1α對失血性休克血管舒張反應性的調節(jié)作用
　　 各休克組SMA血管環(huán)對低濃度SNP(10-9、10-8、10-7 mol/L)的舒張反應性降低;寡霉素可進一步降低其最大舒張反應。休克后血管對Ach的舒張反應性呈下降-上升-再下降的趨勢,即在休克即刻有一短暫降低,隨后呈代償性增加,休克2小時達峰值,2小時后呈下降趨勢;

9、使用寡霉素后,血管對Ach的舒張反應性在休克早期(休克即時-休克1小時)顯著下降,而在休克晚期(休克2小時-休克4小時)呈上升趨勢。與正常組相比,休克后HIF-1α mRNA的表達增加;與休克早期的內皮依賴的舒張反應呈正相關,而與休克晚期的呈負相關,與內皮非依賴的舒張反應性沒有相關性。結果說明:HIF-1α對于非內皮依賴的血管舒張反應性僅在休克早期存在正性調節(jié)作用,對內皮依賴的血管舒張反應性,在休克早期呈正性調節(jié)作用,而在休克晚期呈負向

10、調節(jié)。
　　 2.HIF-1α對缺血缺氧血管舒張反應性的調節(jié)作用與MEGJ的關系
　　 (1)HIF-1α對缺血缺氧血管舒張反應性的調控作用:經(jīng)過體外缺血缺氧處理的大鼠SMA血管環(huán)與失血性休克后血管環(huán)對Ach的內皮依賴性舒張反應性具有相似的變化趨勢,即SMA血管環(huán)對Ach的舒張反應性呈先下降,后上升,再下降的趨勢。缺氧處理SMA血管環(huán)的最大舒張反應在缺氧1h時達到最大,其后逐步下降,以缺氧4h最差。與缺氧對照組比較,寡霉

11、素使SMA血管環(huán)最大舒張反應在休克早期下降,而在休克后期上升。寡霉素處理即刻組顯著差于缺氧對照組,而3h和4h的寡霉素處理組最大舒張反應均高于缺氧對照組。結果說明:HIF-1α對體外缺血缺氧處理大鼠SMA血管舒張反應性與休克處理在體內具有同樣的調節(jié)作用,即對內皮依賴性的血管舒張反應性在缺血缺氧早期存在正性調節(jié)作用,而在缺血缺氧晚期存在負向調節(jié)。
　　 (2)Cx40和Cx43對缺血缺氧血管舒張反應性的調控作用:Cx40AODN和

12、Cx43AODN轉染后,SMA血管組織Cx40和Cx43 mRNA表達明顯下降。缺氧處理使SMA血管環(huán)對Ach的內皮舒張反應性下降。使用Cx40 AODN阻斷Cx40表達后,缺氧處理SMA血管環(huán)在缺氧4h對Ach的舒張反應性顯著高于空白對照組,而與正常組和缺氧1h組無差異。使用Cx43 AODN后,血管環(huán)的舒張反應性在未進行缺氧處理時顯著下降,而缺氧處理后與空白對照組無差異。結果說明:MEGJ Cx40和Cx43參與了休克后血管舒張反應

13、性的調節(jié),Cx40降低休克晚期血管舒張反應性,Cx43升高休克早期血管舒張反應性。
　　 (3)HIF-1α調節(jié)血管舒張反應性與Cx40和Cx43的關系:使用銀杏葉提取物EGb761后,HIF-1α mRNA的表達增高,與空白對照組相比,以正常組和缺氧4h組的增加較為明顯。使用EGb761后,各組Cx40 mRNA表達均較空白對照組顯著提高;而寡霉素使正常組和缺氧4h組Cx40 mRNA表達顯著下降。與空白對照組相比,EGb76

14、1使Cx43 mRNA的表達不同程度下降,以正常組和缺氧1h組較為明顯;而寡霉素使缺氧4h組Cx43 mRNA表達較空白對照組顯著升高。HIF-1α的免疫沉淀可以雜交出各組的Cx43條帶,而只能雜交出正常對照組和缺氧1h組微弱的Cx40條帶。結果說明:HIF-1α可通過上調Cx40的表達和下調Cx43的表達調節(jié)血管舒張反應性的變化;HIF-1α與Cx40、Cx43可能存在直接的結合作用,對Cx43的作用較強,對Cx40的作用相對較弱,其

15、具體結合特性及有無直接作用尚需進一步研究確認。
　　 3.HIF-1α對失血性休克鈣敏感性的調節(jié)作用
　　 失血性休克后,SMA血管環(huán)鈣敏感性呈現(xiàn)先升高后下降趨勢。血管對鈣濃度的量一效曲線在休克0.5 h明顯左移,Emax顯著增加。在休克2h至4h,血管環(huán)對Ca2+敏感性明顯下降,Ca2+的量效曲線明顯右移,Emax顯著降低。使用寡霉素后,SMA血管環(huán)對鈣濃度的量-效曲線均右移,以休克1h和休克2h組較為顯著。寡霉素降低

16、了休克早期的鈣敏感性,并使其在休克后期上升;其中,以休克0.5h組和休克1h組下降較為明顯。休克后,MLC20磷酸化水平出現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢。與正常組相比,休克即刻升高明顯;隨休克時相延長逐步下降,休克3h組和休克4h組明顯低于正常組。使用寡霉素抑制HIF-1α后,MLC20磷酸化水平?jīng)]有出現(xiàn)先升高后下降的趨勢,各組間均無顯著差異。而與休克組相比,寡霉素處理組在休克即刻的高磷酸化水平受到顯著抑制,而休克3h組和休克4h組的磷酸化水

17、平顯著升高。結果說明:HIF-1α參與了失血性休克后血管鈣敏感性的調節(jié),在休克早期有正性調節(jié)作用,而在休克晚期呈負向調節(jié)。
　　 結論:
　　 1.HIF-1α參與了失血性休克后血管舒張反應性的調節(jié)。對于非內皮依賴的血管舒張反應性僅在休克早期存在正性調節(jié)作用;對內皮依賴的血管舒張反應性,在休克早期存在正性調節(jié)作用,而在休克晚期存在負向調節(jié)作用。
　　 2.MEGJ Cx40可能參與了休克晚期血管舒張反應的下降,C