缺氧誘導(dǎo)因子1在嚴(yán)重?zé)齻缙谘芡ㄍ感哉{(diào)控中的作用.pdf

1、血管內(nèi)皮的損傷是嚴(yán)重?zé)齻缙谥匾牟±碜兓?，在燒傷早期損害中起重要作用。血管通透性改變是嚴(yán)重?zé)齻缙谘軆?nèi)皮損害的主要表現(xiàn)之一，也是嚴(yán)重?zé)齻缙诮M織水腫、體液外滲的重要病理基礎(chǔ)。血管通透性的變化及其調(diào)控機(jī)制的研究，對燒傷休克期的處理以及預(yù)防燒傷早期損害均有重要意義。但是，嚴(yán)重?zé)齻笱軆?nèi)皮細(xì)胞通透性變化的機(jī)制及調(diào)控途徑目前尚不清楚。 研究表明，血管通透性變化與調(diào)節(jié)涉及細(xì)胞骨架重組、粘附連接、緊密連接結(jié)構(gòu)與功能改變等不同的機(jī)制

2、。內(nèi)皮細(xì)胞收縮性改變是不同原因引起通透性增加的共同通路，主要受骨架蛋白中肌球蛋白和肌動蛋白的影響，依賴于肌球蛋白輕鏈(myosinlightchain，MLC)的磷酸化。肌球蛋白輕鏈激酶(myosinligiltchainkinase，MLCK)和肌球蛋白輕鏈磷酸酶(myosinlightchainphosphatase，MLCP)在MLC磷酸化的調(diào)控中起著極重要的作用。MLCK的激活可引起MLC的磷酸化；ROCK信號通路活化后，MLC

3、P的磷酸化水平增加，降低MLC的去磷酸化水平，細(xì)胞中磷酸化MLC的水平升高。磷酸化的MLC活化肌球蛋白頭部的ATP酶，產(chǎn)生的能量使細(xì)胞骨架肌動蛋白微絲(F-actin)滑動，細(xì)胞發(fā)生收縮。 熱力或某些化學(xué)物可直接損傷燒傷局部的血管內(nèi)皮細(xì)胞，但遠(yuǎn)隔燒傷部位的血管內(nèi)皮細(xì)胞的損害則為間接因素所致。燒傷血清是燒傷導(dǎo)致機(jī)體病理生理改變的綜合性體液因素，含有大量氧自由基、炎癥介質(zhì)和多種細(xì)胞因子。缺血缺氧是嚴(yán)重?zé)齻缙谥匾牟±砩碜兓?，也?/p>

4、嚴(yán)重?zé)齻蠖喾N因素造成組織細(xì)胞損害的共同途徑，缺血缺氧性損害是嚴(yán)重?zé)齻缙谘芡ㄍ感栽黾拥闹匾獧C(jī)制。大量的轉(zhuǎn)錄因子參與缺氧條件下細(xì)胞及機(jī)體的各種反應(yīng)，而缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxiainduciblefactor-1，HIF-1)被認(rèn)為是介導(dǎo)機(jī)體缺氧反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子。目前認(rèn)為，不僅HIF-α蛋白的降解是一個氧濃度依賴的過程，通過缺氧誘導(dǎo)因子1抑制因子(factorinhibitingHIF-1，F(xiàn)IH)的作用，HIF-1α的反式激活

5、功能也受分子氧的調(diào)節(jié)。常氧條件下，F(xiàn)IH通過不同的機(jī)制抑制HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性，F(xiàn)IH與HIF-1腩氨酰羥化酶1-3(HIF-1prolylhydroxylase1-3，HPH1-3)共同構(gòu)成了機(jī)體對氧濃度變化的感受器，參與缺氧條件下機(jī)體反應(yīng)的調(diào)控。但是，HIF-1α以及FIH在缺氧條件下血管通透性變化中的作用目前尚不清楚。 為了探討嚴(yán)重?zé)齻笱軆?nèi)皮細(xì)胞通透性變化及調(diào)控的機(jī)制，尤其是探究HIF-1α及FIH在缺氧條件下血管通

6、透性變化中的作用，本研究在觀察嚴(yán)重?zé)齻缙诖笫笱芡ㄍ感宰兓幕A(chǔ)上，以體外培養(yǎng)的單層血管內(nèi)皮細(xì)胞為實驗?zāi)Ｐ?，探究MLC磷酸化的升高及其介導(dǎo)的通透性變化在燒傷血清刺激和缺氧(1％O2)誘導(dǎo)后血管通透性變化中的作用和相關(guān)機(jī)制；通過建立HIF-1α高表達(dá)(Forcedexpression)和HIF-1α低表達(dá)(Knockdown)、FIH高表達(dá)血管內(nèi)皮細(xì)胞系，探討HIF-1α、FIH在缺氧條件下MLC磷酸化水平變化及血管通透性變化調(diào)控中的作

7、用和機(jī)制。 材料與方法： 1.采用大鼠30％TBSAⅢ度燒傷模型，檢測正常及傷后2h、4h、6h、12h、24h不同時相點心、肝、肺、腎、空腸、回腸組織血管通透性及組織含水量；以體外培養(yǎng)的單層血管內(nèi)皮細(xì)胞為模型，觀察燒傷大鼠血清刺激后細(xì)胞單層細(xì)胞完整性與通透性變化，檢測p-MLC蛋白的表達(dá)與變化、細(xì)胞骨架的重排，應(yīng)用ML-9、Y-27632等阻斷劑觀察MLCK以及ROCK通路在燒傷血清刺激后血管通透性變化中的作用。檢測燒

8、傷血清刺激后MLCK、ROCK-Ⅱ以及ZO-1等細(xì)胞連接相關(guān)蛋白的表達(dá)與變化。 2.以體外培養(yǎng)的單層血管內(nèi)皮細(xì)胞為模型，觀察缺氧(1％O2)條件下單層細(xì)胞完整性與通透性的變化，檢測p-MLC蛋白的表達(dá)與變化、細(xì)胞骨架重排，應(yīng)用阻斷劑ML-9觀察MLCK通路在缺氧條件下血管通透性變化中的作用。檢測缺氧誘導(dǎo)后MLCK及ZO-1等細(xì)胞連接相關(guān)蛋白的表達(dá)與變化，分別應(yīng)用放線菌素D和放線菌酮，觀察轉(zhuǎn)錄與翻譯過程在缺氧誘導(dǎo)的MLCK表達(dá)中的

9、作用。 3.觀察缺氧(1％O2)條件下，人血管內(nèi)皮細(xì)胞中HIF-1α蛋白水平的表達(dá)變化、核轉(zhuǎn)位以及DNA結(jié)合能力、轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)能力的變化；應(yīng)用缺氧模擬劑DMOG刺激細(xì)胞，觀察常氧條件下MLCK以及p-MLC蛋白水平的表達(dá)以及變化；通過轉(zhuǎn)染含有人HIF-1α全長cDNA序列的質(zhì)粒(pcDNA3.1-V5-HisA-HIF-1α)構(gòu)建的HIF-1α高表達(dá)細(xì)胞系和通過轉(zhuǎn)染針對HIF-1α的siRNA質(zhì)粒(pSUPER-si-HIF-1α)

10、構(gòu)建的HIF-1α低表達(dá)細(xì)胞系，研究HIF-1α在缺氧條件下MLC磷酸化所介導(dǎo)的血管內(nèi)皮通透性改變中的作用。 4.觀察缺氧(1％O2)以及DMOG誘導(dǎo)下，人血管內(nèi)皮細(xì)胞中FIH蛋白水平的表達(dá)變化，通過轉(zhuǎn)染含有人FIH全長cDNA序列的質(zhì)粒(pcDNA3-FIH)構(gòu)建FIH高表達(dá)(Forcedexpression)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞系，研究FIH在缺氧條件下MLC磷酸化所介導(dǎo)的血管內(nèi)皮通透性改變中的作用。 主要結(jié)果：

11、 1.嚴(yán)重?zé)齻?h，大鼠心、肺、腎臟的血管通透性明顯增加，燒傷后4h觀察到肝臟血管通透性的增加。隨后，隨著時間的延續(xù)，各臟器的通透性有一個降低的過程，在傷后12h，各臟器的通透性再次升高，并在我們的觀察期間(24h)，維持在一個相對較高的水平。嚴(yán)重?zé)齻?h，大鼠腎臟含水量即有明顯增加，心臟含水量傷后4h開始增加，12h、24h明顯高于正常水平；12h、24h肝臟組織含水量明顯高于正常。傷后12h空腸組織含水量明顯高于正常。

12、2.燒傷血清刺激后，單層細(xì)胞的TER明顯降低，通透系數(shù)增加，細(xì)胞中p-MLC水平升高，細(xì)胞骨架明顯重排，應(yīng)力纖維形成。ML-9、Y-27632預(yù)處理后TER降低幅度明顯減小，細(xì)胞骨架重排減輕，應(yīng)力纖維明顯減少。ML-9預(yù)處理可明顯降低燒傷血清誘導(dǎo)p-MLC的升高。燒傷血清明顯誘導(dǎo)了MLCK、ZO-1蛋白的表達(dá)，而ROCK-Ⅱ、Occludin、Claudin1等蛋白表達(dá)無明顯變化。 3.缺氧誘導(dǎo)后，單層細(xì)胞完整性被破壞，TER明

13、顯降低，通透系數(shù)明顯增加，細(xì)胞p-MLC水平升高，細(xì)胞骨架明顯重排，應(yīng)力纖維形成。ML-9預(yù)處理后TER降低明顯減弱，細(xì)胞骨架重排減輕，應(yīng)力纖維明顯減少。ML-9預(yù)處理可明顯抑制缺氧誘導(dǎo)后p-MLC的升高。缺氧明顯誘導(dǎo)了MLCK、ZO-1蛋白的表達(dá)，而Occludin、Claudin1等蛋白表達(dá)無明顯變化。放線菌素D和放線菌酮預(yù)處理降低缺氧誘導(dǎo)的MLCK、p-MLC蛋白水平的升高。 4.缺氧條件下HIF-1α、HIF-2α蛋白水

14、平明顯升高。缺氧6h，HIF-1α核轉(zhuǎn)位、與DNA結(jié)合的能力、轉(zhuǎn)錄活性均明顯增強。常氧條件下DMOG刺激不僅HIF-1α、HIF-2a蛋白水平明顯增加，MLCK、p-MLC、ZO-1蛋白水平也明顯升高。缺氧條件下建立的HIF-1α高表達(dá)細(xì)胞系HIF-1α蛋白、mRNA水平明顯增加，而HIF-1α低表達(dá)細(xì)胞系HIF-1α蛋白、mRNA水平明顯降低，核轉(zhuǎn)位明顯減弱。缺氧24h，HIF-1α高表達(dá)細(xì)胞系TER降低幅度加大，p-MLC、MLCK

15、、ZO-1蛋白水平增加更明顯，而HIF-1α低表達(dá)細(xì)胞系TER的降低幅度減小，p-MLC、MLCK、ZO-1蛋白增加幅度明顯降低，細(xì)胞骨架重排減輕。 5.缺氧和常氧條件下，DMOG處理均可降低VE細(xì)胞中FIH蛋白水平，建立的FIH高表達(dá)細(xì)胞系中FIH蛋白水平均明顯升高，明顯抑制HIF-1α轉(zhuǎn)錄活性。缺氧24h，F(xiàn)IH高表達(dá)細(xì)胞系TER降低幅度明顯降低，p-MLC、ZO-1蛋白水平亦明顯降低，細(xì)胞骨架重排明顯減輕。 結(jié)論：

16、 1.嚴(yán)重?zé)齻缙谛摹⒎?、腎、肝等主要臟器的血管通透性、組織含水量明顯增加。燒傷血清明顯損害體外培養(yǎng)的單層血管內(nèi)皮細(xì)胞的完整性，p-MLC蛋白水平升高介導(dǎo)燒傷血清刺激后通透性的增加。MLCK、ROCK通路均參與了燒傷血清刺激后p-MLC表達(dá)的調(diào)控。燒傷血清刺激后MLCK蛋白水平的增加，是p-MLC升高的重要調(diào)控機(jī)制。 2.缺氧明顯損害體外培養(yǎng)的單層血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性，p-MLC蛋白水平升高介導(dǎo)缺氧后通透性的增加。MLCK

17、通路是缺氧后p-MLC表達(dá)調(diào)控的重要途徑。缺氧誘導(dǎo)后MLCK蛋白水平的增加，是p-MLC升高的重要機(jī)制，該過程是一個轉(zhuǎn)錄依賴的過程。同時，缺氧后ZO-1蛋白明顯增加，可能參與缺氧條件下通透性變化的調(diào)控。 3.缺氧條件下，HIF-1α蛋白水平及活性的增加在血管通透性的變化以及調(diào)控中發(fā)揮重要作用。HIF-1α參與調(diào)控缺氧條件下MLCK蛋白水平的升高及單層細(xì)胞中p-MLC水平增加、細(xì)胞骨架的重排和應(yīng)力纖維的形成。另外，HIF-1α也可