缺氧誘導(dǎo)因子-1α在胰腺癌中的靶向治療研究.pdf

1、第一部分：缺氧誘導(dǎo)因子-1α在胰腺組織中的mRNA表達與胰腺癌生物學(xué)特征的關(guān)系 目的初步探討缺氧誘導(dǎo)因子-1α在胰腺癌中mRNA水平的表達與胰腺癌的血管形成、胰腺癌細胞的增殖、分化和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特性之間的關(guān)系。方法采用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測缺氧誘導(dǎo)因子-1α在胰腺癌的癌組織和癌旁組織中mRNA水平的表達，采用免疫組織化學(xué)SP法檢測survivin、PCNA和CD34在胰腺癌組織中的表達水平。統(tǒng)計學(xué)分析用SPSS1

2、2.0統(tǒng)計軟件進行各組缺氧誘導(dǎo)因子-1α表達水平的方差分析、配對t檢驗、兩樣本t檢驗并用Spearman相關(guān)關(guān)系和簡單線性相關(guān)關(guān)系分析以明確缺氧誘導(dǎo)因子-1α表達水平與survivin、PCNA、CD34表達之間的關(guān)系。結(jié)果缺氧誘導(dǎo)因子-1α在胰腺癌的癌與癌旁組織中mRNA水平的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義.缺氧誘導(dǎo)因子-1α的表達水平在不同分化程度的腫瘤細胞中的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。JPS分期STAGEⅠ-Ⅱ和STAGEⅢ-Ⅳ兩組的缺氧誘導(dǎo)因子-

3、1α表達水平的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。缺氧誘導(dǎo)因子-1α的表達與腫瘤細胞的增殖、凋亡和腫瘤的血管形成等生物學(xué)行為相關(guān)的三個指標即PCNA、survivin、CD34的表達之間密切相關(guān)。結(jié)論缺氧誘導(dǎo)因子-1α的表達水平與胰腺癌的血管形成、胰腺癌細胞的增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移等的關(guān)系有統(tǒng)計學(xué)意義。 第二部分：體外實驗：應(yīng)用RNA干擾技術(shù)研究缺氧誘導(dǎo)因子-1α在胰腺癌細胞的增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移過程中的作用 目的探討缺氧對胰腺癌細胞增殖、凋亡和轉(zhuǎn)

4、移的影響以及缺氧誘導(dǎo)因子-1α在這個過程中所發(fā)揮的作用并探討靶向缺氧誘導(dǎo)因子-1α作為胰腺癌治療方法的可能性。方法構(gòu)建了缺氧誘導(dǎo)因子-1α的siRNA表達載體，并進行胰腺癌細胞的轉(zhuǎn)染，通過該質(zhì)粒使得胰腺癌細胞內(nèi)的缺氧誘導(dǎo)因子-1α的表達抑制，再用MTT法測定在缺氧和常氧狀態(tài)下繪制胰腺癌細胞(缺氧誘導(dǎo)因子-1α的表達受抑制和未受抑制的胰腺癌細胞)的生長曲線；利用AnnexinV-PE和7AAD雙標記試劑盒對細胞進行標記，并通過流式細胞儀檢

5、測細胞凋亡；用Transwell測細胞轉(zhuǎn)移能力；最后RT-PCR和Westernb1ot方法檢測缺氧誘導(dǎo)因子-1α、survivin、VEGF、NM23a、促血管生成素-1和細胞增殖核抗原(PCNA)的表達情況。結(jié)果在缺氧狀態(tài)下，胰腺癌細胞生長增快，凋亡減少、轉(zhuǎn)移能力增加并均有統(tǒng)計學(xué)意義，同時缺氧誘導(dǎo)因子-1α、PCNA、survivin和VEGF表達增加，而促血管生成素-1(angiopoietin-1)和nm23a表達減少。轉(zhuǎn)染缺氧

6、誘導(dǎo)因子-1αsiRNA表達載體后，胰腺癌細胞對于缺氧的適應(yīng)性下降，表現(xiàn)出與轉(zhuǎn)染前缺氧時相反的效應(yīng)并有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論缺氧誘導(dǎo)因子-1α可能與缺氧狀態(tài)下胰腺癌細胞的一系列適應(yīng)性反應(yīng)密切相關(guān)。缺氧誘導(dǎo)因子-1α具有成為胰腺癌治療有效靶分子的潛力。 第三部分：體內(nèi)實驗：建立胰腺癌的種植瘤模型和轉(zhuǎn)移模型進一步研究缺氧誘導(dǎo)因子-1α對于胰腺癌生物學(xué)特征的影響 目的在第二階段的研究結(jié)果基礎(chǔ)上，通過建立體內(nèi)腫瘤模型進一步探索缺氧誘導(dǎo)

7、因子-1α作為胰腺癌治療靶分子的有效性。方法對胰腺癌細胞進行缺氧和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染兩種干預(yù)處理，再應(yīng)用各細胞株建立裸鼠皮下種植腫瘤模型和尾靜脈轉(zhuǎn)移模型，四周后觀察成瘤大小和肝臟、肺內(nèi)的轉(zhuǎn)移情況。將取得的腫瘤、肝臟和肺組織標本制成石蠟塊，通過免疫組織化學(xué)方法檢測各組織中缺氧誘導(dǎo)因子-1α、細胞增殖核抗原、survivin、CD34表達，并用TUNEL法檢測凋亡率。結(jié)果相比于轉(zhuǎn)染缺氧誘導(dǎo)因子-1αsiRNA表達載體的胰腺癌細胞，未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的胰腺癌細

8、胞經(jīng)過缺氧處理后，其成瘤體積、轉(zhuǎn)移灶數(shù)目和大小明顯增加，缺氧誘導(dǎo)因子-1α、細胞增殖核抗原、survivin和CD34表達上調(diào)并有統(tǒng)計學(xué)意義，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒(pGenesil-1-HK)的胰腺癌細胞所形成的腫瘤組織中，常氧培養(yǎng)者凋亡率沒有缺氧培養(yǎng)者高，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義。而轉(zhuǎn)染缺氧誘導(dǎo)因子-1αsiRNA表達載體后，其致瘤性明顯下降，成瘤體積小，轉(zhuǎn)移能力下降有統(tǒng)計學(xué)意義，即轉(zhuǎn)移灶數(shù)目和大小明顯降低。而上述各分子表達明顯下調(diào)。各轉(zhuǎn)移灶