VEGF調(diào)控縫隙連接蛋白Cx43促進(jìn)EPCs增殖，遷移及損傷血管修復(fù)的研究.pdf

1、目的：
　　血管損傷性疾病是指各種原因引起血管結(jié)構(gòu)或功能受損的疾病，發(fā)病率逐年升高，嚴(yán)重威脅人類健康。因此，如何促進(jìn)損傷血管修復(fù)具有重大的科學(xué)研究價(jià)值和社會效益。內(nèi)皮細(xì)胞排列在血管壁內(nèi)層，在維持血管解剖和生理功能中發(fā)揮著重要的作用。各種病因可使內(nèi)皮細(xì)胞受損，內(nèi)皮完整性被破壞，最終導(dǎo)致動脈粥樣硬化，是血管損傷性疾病的中心環(huán)節(jié)和始動因素。過去大家普遍認(rèn)為血管損傷的修復(fù)主要依靠鄰近成熟內(nèi)皮細(xì)胞增殖并遷移至損傷區(qū)域。但成熟內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力

2、較低，極大限制其在血管損傷修復(fù)中的作用。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)來源于骨髓或脾臟等組織，是一類可分化為內(nèi)皮細(xì)胞的祖細(xì)胞。既往許多研究證實(shí)，當(dāng)血管損傷時(shí)，機(jī)體動員EPCs至外周血，經(jīng)血液循環(huán)歸巢到血管損傷區(qū)域，增殖、分化為內(nèi)皮細(xì)胞，參與血管損傷修復(fù)。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial groth factor, VEGF）在生物體內(nèi)廣泛存在，有研究表明可體外增

3、強(qiáng)EPCs分化、增殖等功能。而增加損傷血管局部VEGF表達(dá)，可促進(jìn)EPCs歸巢至靶區(qū)域，分化為內(nèi)皮、抑制平滑肌增殖，是血管損傷修復(fù)中的關(guān)鍵因素之一，但其具體機(jī)制尚不完全清楚。
　　縫隙連接蛋白(connexin，Cx)是構(gòu)成細(xì)胞間縫隙連接(gap juncition，GJ)的基本單位。6個(gè)縫隙連接蛋白在細(xì)胞膜上構(gòu)成中空的通道即連接子(connexon)。相鄰細(xì)胞間的連接子吻合形成縫隙連接通道(gap junction channe

4、ls，GJs)，介導(dǎo)相鄰細(xì)胞間能量、物質(zhì)交換。在目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的20種縫隙連接蛋白中，Cx43在血管廣泛分布，是維持血管正常功能的重要成分，與血管損傷性疾病疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。進(jìn)一步研究指出，Cx43可介導(dǎo)干祖細(xì)胞間形成縫隙連接。因此，本研究擬觀察VEGF是否通過增強(qiáng)Cx43的表達(dá)，使縫隙連接功能增強(qiáng)，從而促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖、遷移;此外，構(gòu)建SD大鼠頸動脈損傷模型，探究Cx43是否參與VEGF介導(dǎo)的血管損傷修復(fù)。
　　方法：

5、r>　　2.1 EPCs培養(yǎng)，鑒定
　　從大鼠脾臟組織中分離、培養(yǎng)EPCs，分別于培養(yǎng)的第1天、第4天和第7天鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照，使用FITC-UEA-I和DiI-ac-LDL雙染對細(xì)胞進(jìn)行鑒定。用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞表面的EPCs標(biāo)志性抗原（CD34，VEGFR-2）進(jìn)行鑒定。
　　2.2免疫熒光檢測Cx43在EPCs中的表達(dá)和定位
　　培養(yǎng)7天的EPCs，孵育Cx43一抗和熒光標(biāo)記二抗，激光共聚焦顯微鏡下觀察EPC

6、s中Cx43的表達(dá)和定位。
　　2.3 Western blot檢測不同濃度VEGF調(diào)控EPCs中Cx43的表達(dá)及Cx43干擾siRNA轉(zhuǎn)染效果
　　培養(yǎng)7天的EPCs，分別給予0、10、50ng/mL VEGF刺激，進(jìn)行western blot實(shí)驗(yàn)，觀察Cx43表達(dá)的差異;分別用生理鹽水、空載siRNA、Cx43干擾siRNA處理細(xì)胞，進(jìn)行western blot實(shí)驗(yàn)，觀察Cx43干擾siRNA的轉(zhuǎn)染效果。
　　2.

7、4熒光漂白恢復(fù)(fluorescence redistribution after photobleaching，F(xiàn)RAP)實(shí)驗(yàn)檢測VEGF調(diào)控Cx43對相鄰EPCs間縫隙連接功能的影響
　　細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為3組:①對照組②VEGF組③VEGF+siCx43組。培養(yǎng)7天的EPCs根據(jù)分組處理后利用FRAP實(shí)驗(yàn)檢測各組相鄰EPCs間縫隙連接功能，根據(jù)熒光恢復(fù)率評價(jià)縫隙連接功能;
　　2.5觀察VEGF調(diào)控Cx43對EPCs增殖、遷

8、移的影響
　　培養(yǎng)7天的EPCs同步化后，按照細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組處理后，CCK8檢測EPCs增殖活性，Transwell檢測EPCs遷移能力。
　　2.6 VEGF調(diào)控Cx43參與血管損傷修復(fù)的在體研究
　　2.6.1大鼠先行脾臟切除術(shù)，8天后再行頸動脈損傷。在大鼠頸動脈球囊損傷24小時(shí)后，將Dio-perchlorate標(biāo)記的EPCs2×106混懸在200μl PBS中從尾靜脈注射。細(xì)胞移植前按照動物實(shí)驗(yàn)分組對細(xì)胞進(jìn)行處理

9、。為了觀察EPCs的歸巢情況，3天后處死大鼠，取出目標(biāo)血管做冰凍切片進(jìn)行熒光定位觀察。
　　2.6.2頸動脈損傷7天后各組隨機(jī)選擇三只大鼠，血管內(nèi)注射evans blue，15min后處死大鼠，取出目標(biāo)血管，觀察再內(nèi)皮化情況;頸動脈損傷14天后各組隨機(jī)選擇三只大鼠，處死后取出目標(biāo)血管，HE染色觀察內(nèi)膜增生情況。
　　結(jié)果：
　　3.1成功從大鼠脾臟分離出單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)定向誘導(dǎo)培養(yǎng)后顯微鏡下見內(nèi)皮系特征樣生長，F(xiàn)ITC-

10、UEA-I和DiI-ac-LDL雙染陽性，雙染陽性率為92.00±2.23％(n=5)，CD34和VEGFR-2在培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)陽性率分別為89.67±1.39％(n=3)和92.07±1.35％(n=3)，提示培養(yǎng)細(xì)胞為EPCs。
　　3.2用激光共聚焦顯微鏡觀察，可見細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上均有Cx43發(fā)出的綠色熒光。
　　3.3 WB實(shí)驗(yàn)證實(shí):10ng/mL組Cx43相對表達(dá)量顯著高于0ng/mL組（1.42±0.47 vs1

11、.00±0.31，p＜0.05）(n=5)，且50ng/mL組Cx43相對表達(dá)量顯著高于0ng/mL(2.07±0.49vs1.00±0.31，P＜0.05)(n=5)，50ng/mL組Cx43相對表達(dá)量顯著高于10ng/mL組（2.07±0.49 vs1.42±0.47，P＜0.05）(n=5);Cx43siRNA轉(zhuǎn)染效率為62.95±7.71％（siCx43組vs NS組，0.38±0.13vs1.00±0.14，p＜0.05）(n

12、=3)。
　　3.4熒光漂白恢復(fù)實(shí)驗(yàn)(FRAP)證實(shí):熒光物質(zhì)能夠通過GJs在相鄰EPCs間傳遞。各組相鄰細(xì)胞熒光恢復(fù)率均顯著高于孤立細(xì)胞（control組相鄰細(xì)胞vs control組孤立細(xì)胞，25.85±4.00％ vs11.66±1.62％，p＜0.01），（VEGF組相鄰細(xì)胞vs VEGF組孤立細(xì)胞，65.65±6.24％ vs14.23±1.77％，p＜0.01），（VEGF+siCx43組相鄰細(xì)胞vsVEGF+siCx

13、43組孤立細(xì)胞，31.31±1.53％ vs14.83±7.48％，p＜0.01）(n=6)。VEGF能促進(jìn)EPCs間Cx43介導(dǎo)的縫隙連接（VEGF組vs control組，65.65±6.24％ vs25.85±4.00％，p＜0.01）(n=6)，抑制Cx43表達(dá)后，縫隙連接功能減弱(VEGF組vsVEGF+siCx43組65.65±6.24％ vs31.31±1.53％, p＜0.01)(n=6)。
　　3.5 VEGF調(diào)

14、控Cx43對EPCs增殖、遷移功能的影響
　　3.5.1 VEGF調(diào)控Cx43對EPCs增殖功能的影響
　　使用光密度值（OD值）反映細(xì)胞增殖活性。CCK8分析提示:VEGF組EPCs增殖能力增強(qiáng)（VEGF組vs control組，1.73±0.07 vs0.88±0.08，p＜0.01）(n=6)，而抑制Cx43表達(dá)，EPCs增殖能力減弱(VEGF組vs VEGF+six43組，1.73±0.07 vs1.37±0.11,

15、 p＜0.01)(n=6)。
　　3.5.2 VEGF調(diào)控Cx43對EPCs遷移功能的影響
　　Transwell分析提示:VEGF組EPCs遷移數(shù)量增加(VEGF組vs control組，128.22±3.59個(gè)vs84.14±4.58個(gè)，p＜0.01)(n=12)，而抑制Cx43表達(dá)，EPCs遷移數(shù)量減少(VEGF組vs VEGF+siCx43組，128.22±3.59個(gè)vs104.00±3.92個(gè)，p＜0.05)(n=

16、12)。
　　3.6 VEGF調(diào)控Cx43參與血管損傷修復(fù)的在體研究
　　3.6.1利用熒光標(biāo)記示蹤法檢測Cx43對頸動脈損傷大鼠中EPCs歸巢的影響，熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)，生理鹽水組（saline組）血管內(nèi)膜處未見到綠色熒光標(biāo)記的EPCs;另外3組在血管內(nèi)膜處均可見綠色熒光標(biāo)記的EPCs。VEGF-EPCs組EPCs歸巢數(shù)量增加（VEGF-EPCs組vs EPCs組，15.67±2.08個(gè)vs5.00±2.00個(gè)，p＜0

17、.01）(n=3)(×100)，而抑制Cx43表達(dá)，EPCs歸巢數(shù)量減少（VEGF-EPCs組vsVEGF-siCx43-EPCs組，15.67±2.08個(gè)vs10.67+2.08個(gè)，p＜0.05)(n=3)(×100)。
　　結(jié)論：
　　4.1、大鼠脾臟中分離的單個(gè)核細(xì)胞通過定向培養(yǎng)可獲得EPCs。
　　4.2、Cx43可在EPCs中表達(dá)，分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上。
　　4.3、VEGF可以促進(jìn)Cx43的表達(dá)，且