Src-家族酪氨酸激酶在皮質(zhì)性白內(nèi)障發(fā)生中對(duì)縫隙連接蛋白Cx43的影響.pdf

1、研究背景：
　　前期研究發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)的雞胚晶狀體皮質(zhì)性白內(nèi)障模型中，抑制Src-家族酪氨酸激酶(SFK)活性能有效阻止皮質(zhì)性白內(nèi)障的發(fā)生，這提示Src-家族酪氨酸激酶的異常激活可能參與皮質(zhì)性白內(nèi)障的發(fā)生，但其作用機(jī)理尚不清楚。在對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，SFK通過(guò)使縫隙連接蛋白Cx43相關(guān)位點(diǎn)磷酸化，從而抑制細(xì)胞間通過(guò)縫隙連接的通訊交通功能。晶狀體是一種無(wú)血管組織的器官，晶狀體上皮細(xì)胞和晶狀體表層纖維細(xì)胞間廣泛分布Cx43，它是

2、晶狀體實(shí)現(xiàn)離子、第二信使、代謝產(chǎn)物和水在細(xì)胞間迅速交換的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，對(duì)保持晶狀體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、維持晶狀體透明至關(guān)重要。實(shí)驗(yàn)性皮質(zhì)性白內(nèi)障是否通過(guò)SFK激活，影響了Cx43的表達(dá)、分布或功能，從而參與白內(nèi)障的發(fā)生是本研究關(guān)注的問(wèn)題。
　　目的：
　　探討Src-家族酪氨酸激酶的異常激活在皮質(zhì)性白內(nèi)障的形成中對(duì)晶狀體縫隙連接蛋白Cx43的影響。
　　方法：
　　將胚胎10天(E10)的雞全晶狀體分離并培養(yǎng)在含10％FBS

3、的M199培養(yǎng)液中，共培養(yǎng)10天，以此作為對(duì)照組；在培養(yǎng)液中加入100nM/mlSrc-家族酪氨酸激酶特異性抑制劑PP1的晶狀體作為實(shí)驗(yàn)組。隔日換液，并觀察、拍照記錄、測(cè)量晶狀體的混濁面積，計(jì)算晶狀體的混濁面積百分比。對(duì)培養(yǎng)第1、5和10天兩組晶狀體進(jìn)行以下觀察：利用WGA和DAPI對(duì)晶狀體的冰凍切片進(jìn)行細(xì)胞膜和細(xì)胞核進(jìn)行免疫熒光染色，觀察晶狀體組織學(xué)改變；利用透射電鏡觀察的超微結(jié)構(gòu)變化；通過(guò)對(duì)縫隙連接蛋白Cx43的免疫熒光染色，觀察C

4、x43分布和表達(dá)量的變化；在晶狀體前囊膜上進(jìn)行劃痕-染料負(fù)荷試驗(yàn)，比較染料彌散距離，評(píng)價(jià)縫隙連接的功能的變化。分別采用蛋白免疫印跡法和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)觀察Cx43在蛋白和核酸水平表達(dá)的變化。
　　結(jié)果：
　　對(duì)照組晶狀體在培養(yǎng)的10天里逐漸出現(xiàn)周邊部皮質(zhì)的混濁，混濁面積百分比在第4、10天分別26％和49％，而PP1處理組則為20％和14％，兩組間有顯著性差異(p<0.01)。第一天，兩組晶狀體的組織結(jié)構(gòu)和Cx43的表達(dá)

5、均沒(méi)有明顯變化；第5、10天對(duì)照組晶狀體上皮層與晶狀體纖維出現(xiàn)分離，晶狀體上皮細(xì)胞出現(xiàn)死亡，Cx43主要在晶狀體上皮細(xì)胞間表達(dá)；PP1處理后，不僅晶狀體上皮細(xì)胞間結(jié)合緊密，而且晶狀體上皮層與纖維之間緊密結(jié)合，細(xì)胞死亡明顯減少，Cx43的表達(dá)在上皮與纖維的交界面明顯增強(qiáng)。第10天，PP1組晶狀體上皮層保持正常結(jié)構(gòu)，Cx43的表達(dá)在前囊膜和上皮層之間也有增強(qiáng)。前囊膜的染料負(fù)荷試驗(yàn)顯示，在第1、5、10天，對(duì)照組染料彌散距離分別為50.93±

6、13.19、66.67±7.29、99.52±12.67μm，而PP1組分別為89.54±9.60、69.18±5.49、130.63±10.52μm，第1、10天兩組間有顯著性差異(p<0.01)，PP1組縫隙連接的交通功能明顯增強(qiáng)。免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在各時(shí)間點(diǎn)，PP1有效的抑制了SFK的活性，表現(xiàn)為活性Src(p-Src418)的表達(dá)降低(組間差異p<0.01)。以E10晶狀體為參照，晶狀體上皮中Cx43表達(dá)在D1的兩組中均有增

7、高，在D5的表達(dá)降低，與E10的表達(dá)強(qiáng)度相近，在D10時(shí)Cx43表達(dá)再次升高；兩組間Cx43表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)中，對(duì)照組均高于PP1處理組，在D1和D10兩組間差異明顯(p<0.01)。RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：兩組晶狀體上皮中Cx43在mRNA水平的表達(dá)均不高于E10對(duì)照組，兩組間各時(shí)間點(diǎn)PP1處理組Cx43的表達(dá)均低于對(duì)照組(p<0.05)，其中D5和D10時(shí)差異較大(p<0.05)。
　　結(jié)論：
　　抑制SFK的異常激活增