蛋白酪氨酸激酶Src家族對耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元電壓門控性鈉通道的調(diào)節(jié).pdf

1、耳聾在耳鼻咽喉頭頸外科常見病。由于濫用抗生素、噪聲的污染、人口老齡化及高危遺傳的婚姻等諸多因素，我國難治性感音神經(jīng)性耳聾發(fā)病率正逐年增加。耳聾已成為我國第一致殘疾病。因此防治耳聾，已成為臨床上迫切需要解決的頑癥之一。
　　Src家族是一種非受體型蛋白酪氨酸激酶，它通過催化底物酪氨酸殘端的磷酸化反應(yīng)，將ATP的磷酸基團轉(zhuǎn)移到底物，從而改變底物的構(gòu)象及活性。Src家族共有9個成員，廣泛分布于全身各組織和細(xì)胞中。Src家族成員都有相似的

2、結(jié)構(gòu)，如共有6個功能結(jié)構(gòu)域，其中C-末端的酪氨酸Tyr527和激酶區(qū)活化環(huán)的Tyr416在調(diào)節(jié)Src家族酶活性過程中起著關(guān)鍵的作用。已知在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，Src家族參與調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、遷徙、突觸可塑性等生理過程，并介導(dǎo)缺血性損傷等興奮毒性作用，如Src家族可通過磷酸化與細(xì)胞遷徙相關(guān)的蛋白，調(diào)控神經(jīng)元在發(fā)育過程中的遷徙過程;Src家族成員Src可通過調(diào)控興奮性受體NMDA受體磷酸化水平，促進(jìn)長時程增強或長時程抑制的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)突觸可塑性，這

3、被認(rèn)為與癲癇、阿茨海默氏病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)抑制蛋白酪氨酸激酶Src家族可有效緩解噪聲引起的的耳蝸損害。因此，Src家族可能參與耳聾的病理生理過程。
　　聽覺信息在耳蝸轉(zhuǎn)換為聽神經(jīng)動作電位，傳向中樞。聽神經(jīng)動作電位發(fā)放異常，可導(dǎo)致聽力下降。動作電位的產(chǎn)生主要取決于電壓門控性鈉通道和鉀通道的開放。目前已明確調(diào)控聽神經(jīng)元電壓門控性離子通道磷酸化水平，可影響聽神經(jīng)動作電位發(fā)放。研究雖已證實Src家族可參與調(diào)控電壓門

4、控性鈉通道和鉀通道，但對于Src家族在神經(jīng)系統(tǒng)直接調(diào)控鈉通道和鉀通道的機制，目前并不明確;尤其是在聽覺神經(jīng)系統(tǒng)的研究，尚處于空白。耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元(SGN)是初級聽覺神經(jīng)元，是連接外周毛細(xì)胞和聽覺中樞的重要樞紐，聽神經(jīng)動作電位起于SGN。已知SGN常是噪聲和耳毒性藥物等興奮毒性作用的靶點。SGN的電壓門控性鈉通道和鉀通道開放異?？捎绊懧犃ΑＲ虼嗽诒緦嶒炛?，通過細(xì)胞原代培養(yǎng)技術(shù)，建立SGN體外培養(yǎng)模型;利用全細(xì)胞記錄膜片鉗技術(shù)，觀察內(nèi)

5、源性Src家族被抑制后對SGN電壓門控性鈉通道和鉀通道的作用特點，明確Src家族是否參與調(diào)控聽神經(jīng)系統(tǒng)動作電位的傳導(dǎo)。通過觀察Src家族各種調(diào)節(jié)因子對SGN電壓門控性鈉通道和鉀通道的I-V曲線，鈉電流宏觀激活和失活(macroscopic activation andinactivation)，電導(dǎo)，激活曲線，穩(wěn)態(tài)失活曲線和失活后恢復(fù)曲線等電生理學(xué)特性的作用，明確Src家族在調(diào)控聽神經(jīng)動作電位過程的作用機制。最后觀察Src家族代表性成員

6、Src對SGN鈉通道和鉀通道的作用。通過本實驗，將有利于揭示Src家族在聽神經(jīng)動作電位傳播過程所扮演的角色，也為臨床上耳聾防治提供新的理論指導(dǎo)。
　　實驗內(nèi)容包括以下三部分:
　　第一部分:Src家族對螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元電壓門控性鈉通道和鉀通道的調(diào)控研究目的:觀察蛋白酪氨酸激酶Src家族對原代培養(yǎng)的大鼠螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元(SGN)電壓門控性鈉通道和鉀通道電生理學(xué)性質(zhì)的作用，探討Src家族對SGN聽神經(jīng)動作電位產(chǎn)生過程的影響。

7、r>　　研究方法:將SGN從耳蝸中分離出并原代培養(yǎng)，.24h后結(jié)合免疫熒光染色技術(shù)，首先利用抗N-200抗體和Hoechst3342鑒定SGN，然后用抗Src家族抗體，明確Src家族在SGN的表達(dá)。采用全細(xì)胞記錄膜片鉗技術(shù)，證實去極化刺激引出的內(nèi)向和外向電流分別為電壓門控性鈉通道電流和電壓門控性鉀通道電流。Src家族被抑制后，觀察同時記錄的SGN電壓門控性鈉通道和鉀通道電流的變化，明確Src家族對鈉通道和鉀通道的作用特點。再用無鈉(NM

8、DG)細(xì)胞外液置換正常NaCl細(xì)胞外液，觀察Src家族被抑制后，對SGN電壓門控性鉀電流和I-V曲線的影響，明確Src家族對SGN鉀通道作用。
　　結(jié)果:
　　(1)抗N-200抗體特異標(biāo)記SGN胞膜，Hoechst3342可特異標(biāo)記SGN胞核，證實從耳蝸分離出來的細(xì)胞為SGN。利用抗Src家族抗體，證實Src家族在SGN表達(dá)。
　　(2) TTX和CsCl可分別阻斷由去極化刺激引出的內(nèi)向電流和外向電流，證實內(nèi)向電流為

9、電壓門控性鈉通道電流(INa)，外向電流為電壓門控性鉀通道電流(IK)。
　　(3)10μ M PP2作用后，抑制SGN的INa，INa為作用前59.6±15.7％(n=9，P＜0.05);2μM SU6656作用后也抑制INa，INa為作用前68.6±7.5％(n=5，P＜0.05)。而對照物10μ M PP3和對照溶液作用后不影響SGN的INa。
　　(4) PP，PP3，SU6656以及對照溶液均不影響同時記錄的IK。

10、
　　(5)在NMDG細(xì)胞外液條件下，PP2，SU6656及對照溶液不影響鉀通道I-V曲線的反轉(zhuǎn)電位，也不影響IK。
　　結(jié)論:Src家族抑制后可抑制SGN電壓門控性鈉通道電流，但對電壓門控性鉀通道作用不明顯。
　　第二部分:Src家族對螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元電壓門控性鈉通道的調(diào)控及其電生理學(xué)機制
　　研究目的:觀察Src家族在抑制和激活條件下，對SGN電壓門控性鈉通道電生理學(xué)特性的影響，明確Src家族調(diào)控鈉通道機制。

11、
　　研究方法:通過近距離給藥方式，觀察Src家族抑制劑PP2和SU6656，以及PP2擬合物PP3對SGN電壓門控性鈉通道電流(INa)，I-V曲線，鈉電流宏觀激活和失活，電導(dǎo)，激活曲線，穩(wěn)態(tài)失活曲線和失活后恢復(fù)曲線的作用。Src家族激活劑EPQ(pY)EEIPIA及其對照物則通過細(xì)胞內(nèi)給藥途徑，同樣觀察Src家族激活后，SGN鈉通道電流，I-V曲線及動力學(xué)性質(zhì)的變化。
　　結(jié)果:
　　(1)10μ M PP2作用后

12、抑制SGN的INa，INa為給藥前59.7±10％(n=7，P＜0.05)。2μM SU6656作用后也抑制INa，INa為給藥前62±8.8％(n=7，P＜0.05)。而10μM PP3和對照溶液不影響INa。
　　(2) PP2和SU6656不影響SGN INa的宏觀激活和失活。
　　(3) PP2和SU6656作用后均抑制鈉通道的I-V曲線峰值，但不影響I-V曲線鈉通道反轉(zhuǎn)電位。而PP3不影響I-V曲線。
　　(

13、4) PP2作用前后，SGN鈉通道的電導(dǎo)值分別為(6.7±1)nS和(5.2±0.7)nS(n=7，P＜0.05);而SU6656作用前后，SGN鈉通道的電導(dǎo)值(11±2.4)nS和(7.9±1.9)nS(n=7，P＜0.05)。PP2和SU6656均抑制SGN鈉通道的電導(dǎo)。PP3不影響對SGN INa的電導(dǎo)。
　　(5) PP2和PP3，SU6656均不影響鈉通道激活曲線。
　　(6)PP2作用前后，鈉通道的半失活電壓(V

14、1/2)分別為(-69.4±0.8)mV和(-77.2±0.5)mV，斜率κ（分別為（9.5±0.4）和（9.6±0.4）(n=11，P＜0.05)，PP2使鈉通道的穩(wěn)態(tài)失活曲線移向超極化方向。SU6656作用前后，V1/2分別為(-64.6±0.3)mV和(-70.1±0.4)mV，κ分別為（7.1±0.3）和（7.7±0.4）(n=9，P＜0.05)，SU6656也使鈉通道的穩(wěn)態(tài)失活曲線移向超極化方向。PP3不影響INa的穩(wěn)態(tài)失活曲

15、線。
　　(7) PP2作用前后，鈉通道失活后恢復(fù)過程的時間常數(shù)分別為(7.8±4.5)ms和(17.4±5.9)ms(n=6，P＜0.05)，SU6656作用前后，鈉通道失活后恢復(fù)過程的時間常數(shù)分別為(5±2.8)ms和(11.2±2.2)ms(n=6，P＜0.05)。PP2和SU6656均延緩失活恢復(fù)過程。PP3不影響鈉通道失活后恢復(fù)過程。
　　(8) EPQ(pY)EEIPIA(1mM)作用后增強INa，INa為作用前

16、131.3±5.2％(n=12，P＜0.05)。對照物EPQYEEIPIA(1mM)和空白對照不影響INa。
　　(9) EPQ(pY)EEIPIA不影響SGN INa的宏觀激活和失活。
　　(10) EPQ(pY)EEIPIA作用后增強鈉通道的I-V曲線峰值。EPQ(pY)EEIPIA和EPQYEEIPIA均不影響鈉通道的I-V曲線反轉(zhuǎn)電位。
　　(11) EPQ(pY)EEIPIA作用后增強SGN鈉通道的電導(dǎo)，作用

17、前后鈉通道的電導(dǎo)值分別為(8.2±1.3)nS和(9.7±1.4)nS(n=9，P＜0.05)。EPQYEEIPIA不影響SGN鈉通道的電導(dǎo)。
　　(12) EPQ(pY)EEIPIA作用前后，鈉通道半激活電壓(V1/2)分別為(-36.4±0.3)mV和(-40.2±0.4)mV，斜率κ為（3.5±0.3）和（3.4±0.4）(n=9，P＜0.05)，鈉通道的激活曲線移向超極化方向。EPQYEEIPIA不影響鈉通道的激活曲線。<

18、br>　　(13) EPQ(pY)EEIPIA和EPQYEEIPIA均不影響鈉通道的穩(wěn)態(tài)失活曲線。
　　(14) EPQ(pY)EEIPIA作用前后，SGN鈉通道的失活后恢復(fù)時間常數(shù)分別為(5.6±2.5)ms和(6.1±2.8)ms(n=10，P＞0.05)。EPQ(pY)EEIPIA不影響鈉通道的失活后恢復(fù)過程。
　　結(jié)論:Src家族的激活可上調(diào)SGN電壓門控性鈉通道的功能。Src家族不僅影響鈉通道的電導(dǎo)，而且同時作用于

19、鈉通道的激活區(qū)和失活區(qū)，影響其激活過程和失活過程。Src家族對鈉通道激活過程和失活過程的影響，與其活性水平有關(guān)。
　　第三部分 Src家族成員Src對螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元電壓門控性鈉通道的作用
　　研究目的:觀察Src對SGN電壓門控性鈉通道電生理特性的影響，明確Src家族單個成員在調(diào)節(jié)SGN電壓門控性鈉通道過程中所起的作用。
　　研究方法:利用全細(xì)胞記錄膜片鉗技術(shù)，通過細(xì)胞內(nèi)給藥途徑，觀察Src特異抑制劑Src40-58

20、對SGN INa，鈉電流宏觀激活和失活，I-V曲線，電導(dǎo)，激活曲線，穩(wěn)態(tài)失活曲線以及失活后恢復(fù)曲線的作用。并觀察PP2預(yù)處理后，Src40-58對SGN INa作用的變化。
　　結(jié)果:
　　(1) Src40-58(0.3mg/ml)抑制SGN INa，INa為給藥前73.8±3.5％(n=10，P＜0.05)。Src40-58還抑制I-V曲線峰值，但不影響反轉(zhuǎn)電位。
　　(2) Src40-58不影響SGN INa的

21、宏觀激活和失活。
　　(3) Src40-58抑制SGN鈉通道的電導(dǎo)，作用前后鈉通道的電導(dǎo)分別為(12±2.5)nS和(10±3)nS(n=7,P＜0.05)。
　　(4) Src40-58作用前后，鈉通道半激活電壓(V1/2)分別為(-38.5±0.4)mV和(-44.3±0.6)mV，斜率κ為（3.8±0.4）和（3.2±0.5）(n=7，P＜0.05);而鈉通道半失活電壓(V1/2)分別為(-63.4±0.4)mV和(

22、-67.9±0.5)mV，斜率κ為（6.54±0.4）和（7.36±0.4）(n=9，P＜0.05)，鈉通道的激活曲線和失活曲線均移向超極化方向。
　　(5) Src40-58影響SGN鈉通道的失活后恢復(fù)曲線。Src40-58作用前后，鈉通道的失活后恢復(fù)時間常數(shù)分別為(1.1±0.5)和(1.7±0.7)ms(n=6，P＜0.05)，Src40-58延緩SGN鈉通道的失活后恢復(fù)過程。
　　(6)10μ M PP2預(yù)處理5mi

23、n，然后給予Src40-58，SGN INa為給藥前96.5±11.7％(n=10，P＞0.05)，此時Src40-58不影響INa的大小，也不影響I-V曲線峰值和反轉(zhuǎn)電位。
　　(7) PP2預(yù)處理后可阻斷Src40-58對SGN鈉通道的電導(dǎo)的抑制作用，作用前后鈉通道的電導(dǎo)分別為(8±0.9)nS和(7.5±1.2)nS(n=7，P＞0.05)。
　　(8)同理，PP2預(yù)處理后，Src40-58作用前后SGN鈉通道的半失活

24、電壓(V1/2)分別為(-71.2±0.4)mV和(-73.3±0.4)mV，斜率κ（為（6.7±0.4）和（7.1±0.3）(n=8，P＞0.05)，穩(wěn)態(tài)失活曲線未出現(xiàn)明顯位移。而半激活電壓(V1/2)分別為(-33.8±0.5)mV和(-39.9±1)mV，斜率κ為(3.7±0.7)和（4.8±0.8）(n=9，P＜0.05)，鈉通道的激活曲線仍移向超極化方向。
　　(9)同理，PP2預(yù)處理后阻斷Src40-58對SGN鈉通道