大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞鉀離子通道特性及順鉑對其的影響.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分：大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞的體外分離及其鑒定
　　 目的：建立新生大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞體外分離及其培養(yǎng)與鑒定的方法。
　　 方法：選用健康新生大鼠，解剖顯微鏡下取出雙側(cè)耳蝸，除去基底膜及蝸軸的神經(jīng)纖維組織，胰蛋白酶消化后種植于DMEM/F12培養(yǎng)液，四天后，倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)，應(yīng)用抗神經(jīng)微絲蛋白單克隆抗體對耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞進行免疫細胞組織化學(xué)染色鑒定。
　　

2、 結(jié)果：按本方法分離可獲得存活狀態(tài)良好的細胞，經(jīng)免疫組織化學(xué)鑒定證實為耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞。
　　 結(jié)論：此方法可以得到內(nèi)耳耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞，其細胞數(shù)量及活性狀態(tài)可滿足膜片鉗記錄等體外實驗研究的需求。
　　 第二部分：大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞電壓依賴性鉀通道的研究
　　 目的：體外分離大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞，記錄耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞膜鉀電流并探討其特性。
　　 方法：利用全細胞膜片鉗技術(shù)記錄鉀電流，從藥理學(xué)

3、和動力學(xué)兩方面觀察鉀通道特性。
　　 結(jié)果：在室溫條件下可記錄到典型的全細胞電壓依賴性鉀電流（IK）及延遲整流鉀電流（IKDR），IK和IKDR均為外向電流，激活電壓分別為-60mV和-50mV；隨著去極化程度增加而增加，能被已知的鉀通道的阻斷劑4-AP和TEA-Cl阻斷，IK和IKDR的半數(shù)最大激活膜電位（V1/2）分別為（25.25±2.15）mV（n=10）和（18.65±1.88）mV（n=10）。
　　 結(jié)論：

4、通過急性分離方法得到的耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞形態(tài)及生理特性良好，較好地表達了電壓依賴性鉀離子通道的特性，適合做進一步的藥理學(xué)及電生理研究。
　　 第三部分：順鉑對耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞外向延遲整流鉀電流的影響
　　 目的：觀察記錄順鉑作用下急性分離新生大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞(Spiral Ganglion Neurons)延遲整流鉀通道的電流曲線，分析順鉑(Cisplatin)對耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞鉀電流激活動力學(xué)的影響，并初步探

5、討其耳毒性機制。
　　 方法：采用全細胞膜片鉗技術(shù)記錄耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞外向延遲整流鉀電流及順鉑對此電流的影響。
　　 結(jié)果：鉗制電壓為-60mV，刺激電壓從-80 mV到+60mV 逐漸去極化，階躍電壓為10 mV,持續(xù)時間為500ms?？稍诙伮菪窠?jīng)節(jié)細胞上記錄到外向鉀電流，該電流對TEA-Cl（4-乙基胺）敏感，具有延遲整流特性；在細胞外液中加入10μmol/L順鉑，能明顯抑制耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞延遲整流鉀電流，+

6、50 mV的去極化電壓刺激后引出的最大穩(wěn)態(tài)電流幅值減少了23.3%；順鉑對此電流的抑制作用與細胞外液中順鉑的濃度呈劑量依賴性，即順鉑濃度越大，對電流的抑制作用越大；外液洗脫后耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞IKDR電流可基本恢復(fù)正常。
　　 結(jié)論：順鉑可抑制耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞鉀通道電流，鉀通道與耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞動作電位的產(chǎn)生密切相關(guān)，抑制鉀通道后動作電位產(chǎn)生受到抑制，聽覺信息傳導(dǎo)功能受損，導(dǎo)致聽覺功能障礙，從電生理角度闡述了順鉑耳毒性部分機