過氧亞硝酸鹽對耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞的損傷作用及機制研究.pdf

1、第一部分姜黃素對過氧亞硝酸鹽損傷大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞的保護作用及機制研究
　　實驗?zāi)康?研究過氧亞硝酸鹽(peroxynitrite，ONOO)對大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞(spiral ganglion neuron，SGN)的氧化損傷作用，并進一步探討姜黃素對對該損傷的保護作用及其機制。
　　實驗方法:體外原代培養(yǎng)大鼠耳蝸SGN細胞，采用免疫細胞化學(xué)熒光染色鑒定后進行后續(xù)實驗。實驗組施加姜黃素預(yù)處理，損傷組施加二甲基亞砜(

2、dimethyl sulfoxide，DMSO)預(yù)處理后分別加入ONOO-，正常對照組不做任何處理。四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測細胞活性，Ho.33342和碘化丙啶(propidium iodide，PI)雙染及流式細胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測細胞凋亡，分光光度計檢測細胞內(nèi)谷胱甘肽(glutathione，GSH)含量，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性以及細胞內(nèi)丙二醛(mal

3、onaldehyde，MDA)水平。RT-PCR分別檢測Apaf-1、Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2和Bax的mRNA表達，westem blot分別檢測SGN細胞線粒體和胞漿內(nèi)Cytochrome c的含量，細胞內(nèi)的活性Caspase-9、活性Caspase-3以及Bcl-2和Bax的蛋白表達。
　　實驗結(jié)果:過氧亞硝酸鹽(100μM)作用于大鼠耳蝸SGN細胞24小時后，MTT結(jié)果顯示細胞存活率降低至正常對照

4、組的59.57±3.02％，細胞凋亡率升高到正常對照組的50.27±3.26％(P＜0.001)，Ho.33342和PI染色顯示ONOO-處理后的SGN細胞中出現(xiàn)了凋亡的細胞及少量的壞死SGN細胞。與損傷組相比，實驗組姜黃素預(yù)處理減輕了ONOO引起的SGN細胞損傷，對SGN細胞具有保護作用且該保護作用具有劑量和時間雙重依賴性，15μM的姜黃素預(yù)處理12h使得細胞存活率升高至峰值，達到正常對照組的97.57±2.01％，細胞凋亡率降低至正

5、常對照組的7.31±0.99％(P＜0.001)。Ho.33342和PI染色進一步證實姜黃素預(yù)處理后ONOO-誘導(dǎo)的凋亡形態(tài)細胞明顯減少，壞死細胞幾乎消失。分光光度檢測顯示ONOO-(100μM)作用SGN細胞24h后，細胞的SOD活性和GSH含量分別降低至正常對照組的36.78±3.62％和45.15±7.03％，而MDA水平則上升至正常對照組的207.36±24.49％，姜黃素預(yù)處理可以提高細胞內(nèi)SOD和GSH的水平分別至正常對照組

6、的86.19±3.13％和116.47±1.75％，并且抑制了MDA水平的升高使其降低至正常組的85.04±3.68％(P＜0.01)。Western blot證實ONOO引起了SGN細胞內(nèi)Cytochrome c自線粒體釋放入胞漿中并相應(yīng)激活了Caspase-9、Caspase-3進而引起了SGN細胞凋亡，并且證明Bcl-2蛋白在此過程中表達降低而Bax蛋白表達升高。RT-PCR顯示凋亡相關(guān)的基因Apaf-1、Caspase-9、Ca

7、spase-3和Bax的mRNA水平在ONOO-損傷SGN細胞過程中表達升高，而Bcl-2的mRNA表達降低。另一方面，實驗組中姜黃素預(yù)處理，阻止了ONOO-誘導(dǎo)的Cytochrome c由線粒體向胞漿的釋放，抑制了Caspase-9和Caspase-3的激活并且消除了Bcl-2家族因子的表達改變，同時分別相應(yīng)調(diào)節(jié)了ONOO-引起的SGN細胞中Apaf-1、Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2和Bax基因的mRNA水平的變

8、化。
　　研究結(jié)論:本研究首次探討了ONOO-和姜黃素對耳蝸SGN細胞的協(xié)同作用。研究證明了ONOO-可以降低大鼠耳蝸SGN細胞的存活率，誘導(dǎo)其凋亡并發(fā)生氧化損傷，該損傷的機制可能與線粒體Caspase-依賴性的凋亡途徑相關(guān)。另一方面，姜黃素可以減輕ONOO-引起的大鼠SGN細胞損傷作用，抑制其誘導(dǎo)的SGN細胞凋亡，該保護作用可能是通過抗氧化及保護細胞線粒體免于氧化應(yīng)激的損傷的機制實現(xiàn)的。因此，姜黃素可作為潛在的抗氧化劑，在防治由

9、于SGN細胞氧化損傷引起的感音神經(jīng)性耳聾中發(fā)揮作用。
　　第二部分凋亡誘導(dǎo)因子和核酸內(nèi)切酶G核轉(zhuǎn)位在過氧亞硝酸鹽誘導(dǎo)大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞凋亡中的作用
　　實驗?zāi)康?研究過氧亞硝酸鹽(peroxynitrite，ONOO-)誘導(dǎo)大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞(spiral ganglion neuron，SGN)發(fā)生的非Caspase-依賴途徑的凋亡，進一步探討凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis inducing factor，AIF

10、)和核酸內(nèi)切酶G(endonuclease G，Endo G)在該凋亡過程中的作用。
　　實驗方法:體外原代培養(yǎng)新生大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞，采用免疫細胞化學(xué)熒光染色鑒定SGN細胞，實驗組加入Caspase廣譜抑制劑Z-VAD-FMK預(yù)處理，損傷組加入DMSO預(yù)處理后，加入ONOO-(100μM)作用SGN細胞24h，正常對照組細胞不做任何處理。吖啶橙染色檢測各處理組細胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變，流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡率的變化。West

11、ern blot分析應(yīng)用Z-VAD-FMK后SGN細胞內(nèi)Caspase-3的激活抑制情況，免疫細胞化學(xué)及激光共聚焦顯微鏡觀察SGN細胞內(nèi)AIF和Endo G由線粒體向細胞核轉(zhuǎn)位的情況，亞細胞器分離技術(shù)及western blot分析AIF和Endo G蛋白在細胞內(nèi)線粒體和細胞漿的分布改變，real-time PCR檢測細胞內(nèi)AIF和Endo G的mRNA表達，western blot進一步分析SGN細胞Bcl-2和Bax蛋白表達的改變情況

12、。
　　實驗結(jié)果:吖啶橙染色顯示ONOO-可引起新生大鼠耳蝸SGN細胞出現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)，流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明細胞凋亡率顯著上升，Z-VAD-FMK預(yù)處理后依然存在ONOO-誘導(dǎo)的大鼠SGN細胞的凋亡，但凋亡細胞數(shù)目減少，細胞凋亡率由損傷組的50.27±3.26％降低為實驗組的24.25±6.35％(P＜0.01)。經(jīng)western blot證實Z-VAD-FMK可以有效抑制SGN細胞內(nèi)Caspase-3的激活后，免疫細胞化學(xué)顯

13、示ONOO--Z-VAD-FMK聯(lián)合作用可以引起SGN細胞內(nèi)AIF和EndoG由線粒體向細胞核轉(zhuǎn)位，分離亞細胞器后檢測AIF和Endo G蛋白顯示，較正常對照組相比，無論施加抑制劑Z-VAD-FMK處理與否，ONOO-均引起SGN細胞內(nèi)AIF和Endo G在線粒體內(nèi)含量的降低，細胞漿內(nèi)含量的升高，及細胞內(nèi)Bcl-2和Bax的蛋白表達改變。Real-time PCR檢測示AIF和Endo G的mRNA表達水平在不同組間未有變化。
　

14、　研究結(jié)論:在Caspase蛋白家族活性被抑制后，ONOO-依然可引起體外原代培養(yǎng)的大鼠耳蝸SGN細胞發(fā)生凋亡，但程度減輕，證明Caspase-非依賴性凋亡途徑在ONOO損傷SGN細胞的過程中亦發(fā)揮部分作用。ONOO-可以誘導(dǎo)大鼠SGN細胞內(nèi)AIF和Endo G自線粒體釋放并進一步轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，且該過程不受Caspase活性的影響，表明AIF和Endo G參與了氮自由基導(dǎo)致的耳蝸SGN細胞的Caspase-非依賴性凋亡。ONOO-調(diào)節(jié)