D-半乳糖對大鼠耳蝸血管紋邊緣細胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細胞擬衰老作用的實驗研究.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分：大鼠血管紋邊緣細胞及螺旋神經(jīng)節(jié)細胞的原代培養(yǎng)及鑒定
　　 目的：建立新生大鼠耳蝸血管紋邊緣細胞(Marginal cells，MCs)和螺旋神經(jīng)節(jié)細胞(Spiral ganglions，SGNs)的體外培養(yǎng)及純化體系。
　　 方法: 出生0-3天的新生Wistar大鼠斷頭后解剖顯微鏡下取出耳蝸側(cè)壁血管紋和含有螺旋神經(jīng)節(jié)的Rosentol管，利用酶消化法制成細胞懸液后接種于細胞培

2、養(yǎng)板，37℃，5[％]CO2/95[％]O2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。MCs使用加入生長因子的MEM –αI培養(yǎng)液，SGNs使用含有10[％]FBS的DMEM-F12培養(yǎng)液。培養(yǎng)早期采用低濃度血清培養(yǎng)基、差異性貼壁、選擇性消化三種方法純化MCs。細胞接種24小時后采用5umol/L阿糖胞苷純化SGNs 48小時，改用NB+B27神經(jīng)細胞專用培養(yǎng)基。純化后細胞爬片，應(yīng)用免疫細胞化學(xué)及電鏡觀察、鑒定培養(yǎng)的細胞。
　　 結(jié)果：MCs接種24h后

3、貼壁生長，后期形成單層“鋪路石”樣外觀，細胞頂端可見分泌小泡，還可見由很多MCs形成的“dome”。采用低濃度血清培養(yǎng)基、差異性貼壁、選擇性消化三種方法能去除大部分成纖維細胞。免疫細胞化學(xué)檢測MCs表達角蛋白-18陽性。SGNs接種24小時候貼壁生長，胞體透明，折光性好，長出小突起。純化后SGNs呈典型的雙極神經(jīng)元形態(tài)，軸突長度是胞體的3-4倍，后期突起延長，相互交織。加入5umol/L阿糖胞苷純化48小時能去除大部分非神經(jīng)細胞。免疫細

4、胞化學(xué)檢測SGNs表達神經(jīng)絲-200陽性。
　　 結(jié)論：新生大鼠利用酶消化法結(jié)合低濃度血清培養(yǎng)基、差異性貼壁、選擇性消化及加入阿糖胞苷等純化方法可以在體外培養(yǎng)出純度較高的MCs和SGNs。為進一步研究MCs和SGNs的生理和病理功能提供良好的實驗?zāi)Ｐ汀?br>　　 第二部分：D-gal誘導(dǎo)血管紋Mcs和SGNs衰老模型的建立
　　 目的：建立D-gal誘導(dǎo)的血管紋邊緣細胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細胞的衰老模型。
　　 方法

5、：純化后的MCs和SGNs培養(yǎng)數(shù)天，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，MTT法繪制細胞生長曲線。純化后細胞分為兩組，實驗組和對照組。濃度梯度：MCs兩組分別給予含有2mg/ml、4mg/ml、6mg/ml、8mg/ml、10mg/ml D-gal和D-glu的培養(yǎng)基；SGNs兩組分別給予含有2mg/ml、4mg/ml、6mg/ml、8mg/ml、10mg/ml D-gal和D-glu的培養(yǎng)基。時間梯度：MCs不同濃度組分別培養(yǎng)24h、48h

6、、72h、96h、120h，SGNs不同濃度組分別培養(yǎng)24h、48h、72h、96h、120h。CCK-8試劑盒檢測細胞活性，細胞計數(shù)，繪制細胞增殖曲線。流式細胞儀檢測細胞周期。巢式PCR法檢測衰老細胞線粒體DNA4834bp缺失情況。熒光定量PCR方法檢測不同濃度和作用時間兩種衰老細胞線粒體DNA4834bp缺失突變率的改變。Β-半乳糖苷酶染色，檢測衰老。
　　 結(jié)果：純化后MCs在培養(yǎng)第九天達到增殖高峰，之后開始出現(xiàn)細胞凋亡

7、和壞死。SGNs不能增殖，在純化后第5天開始出現(xiàn)細胞凋亡和壞死。CCK-8試劑盒檢測MCs 8mg/ml、10mg/ml組培養(yǎng)96h實驗組細胞活性明顯低于對照組。8mg/ml組培養(yǎng)96h、120h實驗組細胞活性明顯低于對照組。SGNs 6mg/ml、8mg/ml、10mg/ml組培養(yǎng)72h后實驗組細胞活性明顯低于對照組。6mg/ml組培養(yǎng)72h、96h、120h實驗組細胞活性明顯低于對照組。衰老細胞存在細胞周期阻滯，S、G2-M期減少，

8、G0-G1期增多。巢式PCR法檢測到衰老細胞存在線粒體DNA4834缺失。熒光定量PCR檢測顯示，8mg/ml D-gal或D-glu作用于MCs，隨著時間的延長，4834bp突變率逐漸變大，96h達到高峰。不同濃度D-gal和D-glu作用MCs96h，中等濃度組(8mg/ml)4834確實突變率達高峰。SGNs 6mg/ml D-gal或D-glu作用72h后4834缺失突變率達高峰。不同濃度D-gal和D-glu作用SGNs72h