D-半乳糖對(duì)大鼠耳蝸血管紋邊緣細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞擬衰老作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分：大鼠血管紋邊緣細(xì)胞及螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定
　　 目的：建立新生大鼠耳蝸血管紋邊緣細(xì)胞(Marginal cells，MCs)和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(Spiral ganglions，SGNs)的體外培養(yǎng)及純化體系。
　　 方法: 出生0-3天的新生Wistar大鼠斷頭后解剖顯微鏡下取出耳蝸側(cè)壁血管紋和含有螺旋神經(jīng)節(jié)的Rosentol管，利用酶消化法制成細(xì)胞懸液后接種于細(xì)胞培

2、養(yǎng)板，37℃，5[％]CO2/95[％]O2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。MCs使用加入生長(zhǎng)因子的MEM –αI培養(yǎng)液，SGNs使用含有10[％]FBS的DMEM-F12培養(yǎng)液。培養(yǎng)早期采用低濃度血清培養(yǎng)基、差異性貼壁、選擇性消化三種方法純化MCs。細(xì)胞接種24小時(shí)后采用5umol/L阿糖胞苷純化SGNs 48小時(shí)，改用NB+B27神經(jīng)細(xì)胞專用培養(yǎng)基。純化后細(xì)胞爬片，應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)及電鏡觀察、鑒定培養(yǎng)的細(xì)胞。
　　 結(jié)果：MCs接種24h后

3、貼壁生長(zhǎng)，后期形成單層“鋪路石”樣外觀，細(xì)胞頂端可見分泌小泡，還可見由很多MCs形成的“dome”。采用低濃度血清培養(yǎng)基、差異性貼壁、選擇性消化三種方法能去除大部分成纖維細(xì)胞。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)MCs表達(dá)角蛋白-18陽性。SGNs接種24小時(shí)候貼壁生長(zhǎng)，胞體透明，折光性好，長(zhǎng)出小突起。純化后SGNs呈典型的雙極神經(jīng)元形態(tài)，軸突長(zhǎng)度是胞體的3-4倍，后期突起延長(zhǎng)，相互交織。加入5umol/L阿糖胞苷純化48小時(shí)能去除大部分非神經(jīng)細(xì)胞。免疫細(xì)

4、胞化學(xué)檢測(cè)SGNs表達(dá)神經(jīng)絲-200陽性。
　　 結(jié)論：新生大鼠利用酶消化法結(jié)合低濃度血清培養(yǎng)基、差異性貼壁、選擇性消化及加入阿糖胞苷等純化方法可以在體外培養(yǎng)出純度較高的MCs和SGNs。為進(jìn)一步研究MCs和SGNs的生理和病理功能提供良好的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br>　　 第二部分：D-gal誘導(dǎo)血管紋Mcs和SGNs衰老模型的建立
　　 目的：建立D-gal誘導(dǎo)的血管紋邊緣細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的衰老模型。
　　 方法

5、：純化后的MCs和SGNs培養(yǎng)數(shù)天，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。純化后細(xì)胞分為兩組，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。濃度梯度：MCs兩組分別給予含有2mg/ml、4mg/ml、6mg/ml、8mg/ml、10mg/ml D-gal和D-glu的培養(yǎng)基；SGNs兩組分別給予含有2mg/ml、4mg/ml、6mg/ml、8mg/ml、10mg/ml D-gal和D-glu的培養(yǎng)基。時(shí)間梯度：MCs不同濃度組分別培養(yǎng)24h、48h

6、、72h、96h、120h，SGNs不同濃度組分別培養(yǎng)24h、48h、72h、96h、120h。CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性，細(xì)胞計(jì)數(shù)，繪制細(xì)胞增殖曲線。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。巢式PCR法檢測(cè)衰老細(xì)胞線粒體DNA4834bp缺失情況。熒光定量PCR方法檢測(cè)不同濃度和作用時(shí)間兩種衰老細(xì)胞線粒體DNA4834bp缺失突變率的改變。Β-半乳糖苷酶染色，檢測(cè)衰老。
　　 結(jié)果：純化后MCs在培養(yǎng)第九天達(dá)到增殖高峰，之后開始出現(xiàn)細(xì)胞凋亡

7、和壞死。SGNs不能增殖，在純化后第5天開始出現(xiàn)細(xì)胞凋亡和壞死。CCK-8試劑盒檢測(cè)MCs 8mg/ml、10mg/ml組培養(yǎng)96h實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活性明顯低于對(duì)照組。8mg/ml組培養(yǎng)96h、120h實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活性明顯低于對(duì)照組。SGNs 6mg/ml、8mg/ml、10mg/ml組培養(yǎng)72h后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活性明顯低于對(duì)照組。6mg/ml組培養(yǎng)72h、96h、120h實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活性明顯低于對(duì)照組。衰老細(xì)胞存在細(xì)胞周期阻滯，S、G2-M期減少，

8、G0-G1期增多。巢式PCR法檢測(cè)到衰老細(xì)胞存在線粒體DNA4834缺失。熒光定量PCR檢測(cè)顯示，8mg/ml D-gal或D-glu作用于MCs，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，4834bp突變率逐漸變大，96h達(dá)到高峰。不同濃度D-gal和D-glu作用MCs96h，中等濃度組(8mg/ml)4834確實(shí)突變率達(dá)高峰。SGNs 6mg/ml D-gal或D-glu作用72h后4834缺失突變率達(dá)高峰。不同濃度D-gal和D-glu作用SGNs72h