神經(jīng)生長因子對螺旋神經(jīng)節(jié)細胞保護作用的實驗研究.pdf

1、各種原因所致耳蝸不可逆性的缺失，引起隨之發(fā)生的螺旋神經(jīng)節(jié)和聽神經(jīng)的凋亡和變性，從而導致感音神經(jīng)性耳聾的發(fā)生。隨著人工耳蝸植入術(CI)，的發(fā)展，多數(shù)保留有足夠數(shù)量螺旋神經(jīng)節(jié)細胞(SGNs)的耳聾患者在這項技術中受益，聽力得到提高。具有一定正常形態(tài)和功能SGNs的數(shù)量對于CI技術的發(fā)展是一個限制性的因素，通常認為殘存的SGNs的數(shù)量應占總量的10％以上。SGNs的存活依賴于聽覺感受器、蝸核、髓鞘等分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子；除此之外，還依賴于毛細

2、胞釋放的神經(jīng)遞質(zhì)如谷氨酸、P物質(zhì)和乙酰膽堿等誘發(fā)的SGNs細胞膜的生物電活動。 在螺旋神經(jīng)節(jié)細胞的存活、再生、軸突的塑型和神經(jīng)網(wǎng)絡的建立中，神經(jīng)生長因子NGF起著不可忽視的作用。NGF是一種高效多能的神經(jīng)營養(yǎng)因子，由三種亞基α、β、γ，按α<,2>βγ<，2>的排列組成，分子量為1300000D，其中只有β亞基具有生物學作用。神經(jīng)生長因子在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育期，具有促進神經(jīng)元的分化，控制神經(jīng)元存活數(shù)量等作用；在神經(jīng)元發(fā)育成熟期，具有維

3、持感覺神經(jīng)元和中樞神經(jīng)元群的功能，促進成熟神經(jīng)元軸索分支等作用；神經(jīng)損傷修復期，NGF具有類似發(fā)育期的作用，支持神經(jīng)元的存活并促進神經(jīng)纖維的生長。Lefebvre等在培養(yǎng)的大鼠耳蝸前庭神經(jīng)節(jié)中加入胚胎12天的聽泡，發(fā)現(xiàn)聽泡能釋放出一種因子促進培養(yǎng)神經(jīng)細胞的存活和軸突的發(fā)生，這種因子的作用類似NGF，其作用能被抗MGF抗體阻斷。 NGF是與其受體相結合后發(fā)揮其生物學效應，高親和力TrkA受體被公認為．NGF功能性受體，與NGF結合

4、能使細胞內(nèi)絡氨酸蛋白激酶活性增高，繼而發(fā)生一系列級聯(lián)反應，最終達到維持細胞存活、促進細胞成熟的效應。Dai在用兔的抗TrkA的多克隆抗體對嚙齒類動物(大鼠、小鼠)進行NGF受體TrkA分布的研究，發(fā)現(xiàn)在大鼠和小鼠中的螺旋神經(jīng)節(jié)細胞均有TrkA的表達。通過與受體的結合，NGF發(fā)揮對SGNs的保護作用。 目前外源性NGF直接提純較為困難，來源受限；并且因其屬于大分子物質(zhì)，不易通過血一迷路屏障，臨床應用存在著很大的難度。內(nèi)耳包被于骨性

5、結構內(nèi)，并因血一迷路屏障的存在而與周圍組織形成相對獨立的微環(huán)境，由于膜性迷路懸浮于內(nèi)、外淋巴的液態(tài)環(huán)境之中，淋巴液的不斷循環(huán)流動，有利于轉(zhuǎn)移載體在膜迷路系統(tǒng)的擴散，賦予內(nèi)耳基因轉(zhuǎn)移自身的特點。腺病毒是一種線性雙鏈DNA病毒，能感染所有類型的細胞，對糾正神經(jīng)細胞的基因缺陷有特殊意義，表達效率高，具有較高的安全性，是一類適合內(nèi)耳基因治療的載體。為了研究外源性β NGF能否經(jīng)病毒介導感染螺旋神經(jīng)節(jié)細胞，發(fā)揮對SGNs的存活作用，我們首先研究了

6、β NGF在不同發(fā)育階段豚鼠耳蝸中的分布規(guī)律，間接了解βNGF在不同階段對耳蝸各部分的作用；然后構建了攜帶綠色熒光蛋白報告基因和βNGF目的片斷的重組腺病毒表達載體AD-β NGF，將AD-β NGF感染離體培養(yǎng)的螺旋神經(jīng)節(jié)細胞和基底膜后并在細胞和組織中獲得了表達；通過圓窗膜注射將AD-βNGF導入豚鼠膜迷路內(nèi)，病毒成功感染柯替器及SGNs；在藥物性耳聾動物模型中，導入β NGF的SGNs存活情況較好，但在腦干誘發(fā)電位測試中Ⅲ波的聽閾值

7、較正常值增高。主要實驗結果如下： 1、選取胚胎20天、出生后7天和成年的豚鼠，常規(guī)制備耳蝸石蠟切片，兔抗小鼠βNGF多克隆抗體(1：200)行免疫組織化學染色。結果顯示胚胎20天的豚鼠耳蝸外嵴部(分化形成柯替器)的細胞胞漿染色陽性，蝸軸中與外嵴部延續(xù)的細胞(幼稚螺旋神經(jīng)節(jié))胞漿染色陽性。出生7天和成年的豚鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞β NGF染色為陽性，發(fā)自神經(jīng)節(jié)細胞的染色陽性的神經(jīng)纖維支配內(nèi)外毛細胞；基底膜上內(nèi)、外毛細胞染色強陽性(深

8、棕黃色)，蝸軸中排列成束的神經(jīng)纖維染色也為陽性。經(jīng)蛋白質(zhì)免疫印跡行定量檢測提示在這三個發(fā)育階段出生后7dNGF含量最多，成年后含量最少。 2、從小鼠頜下腺組織提取總RNA后，用RT-PCR法擴增了924bp長度的小鼠βNGF基因cDNA，經(jīng)過電泳、回收、純化后與攜帶綠色熒光蛋白報告基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdtrack-cmv-eGFP重組成pAdtrack-cmv-eGFP．β NGF，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α后在細菌中擴增質(zhì)粒，

9、經(jīng)過質(zhì)粒抽提、酶切、電泳、回收后與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeasy-1同源重組，經(jīng)酶切鑒定、電泳分析和DNA測序鑒定，924bp的βNGF基因片斷成功插入到腺病毒載體中，插入方向正確。和GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列比對后確認無誤，說明載體構建成功。轉(zhuǎn)化菌擴增后抽提質(zhì)粒，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染293細胞，在293細胞中包裝成具有感染能力的完整的腺病毒顆粒。熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染的第二天即有部分293細胞發(fā)出綠色熒光，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，發(fā)出GFP的293

10、細胞數(shù)目增多，在轉(zhuǎn)染第7～10天時最多，熒光最強，細胞的形態(tài)較正常有變化，形成串珠狀，以后逐漸減弱，發(fā)出熒光的細胞數(shù)減少。在轉(zhuǎn)染的第7～10天是采集病毒液的最佳時期。將細胞破碎離心后，取上清，重復感染293細胞，3天左右即可再次收集病毒液，達到快速擴增病毒液的目的。經(jīng)TCID50法測定，收集的病毒液滴度達1×10<'7.4>PFU/mL。以病毒液為模板，通過βNGF目的基因引物PCR擴增出924bp的目的基因片段，說明腺病毒是重組的，排

11、除了在包裝病毒液的過程中野生型腺病毒的產(chǎn)生。 3、在解剖顯微鏡下分離出生3～5d的小鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞，經(jīng)消化后移入涂有0.1％多聚賴氨酸的平皿中培養(yǎng)，培養(yǎng)中，SGNs一般在12h左右貼壁，24h后呈良好長勢，連續(xù)培養(yǎng)7d細胞體形態(tài)良好，軸突長度無明顯改變，培養(yǎng)到第14d左右，細胞數(shù)目明顯減少，胞體中可見空泡，軸突變小變細，多數(shù)細胞崩解。將病毒液在培養(yǎng)后第2d加入培養(yǎng)液中，顯微鏡下觀察綠色熒光，在轉(zhuǎn)染后第2d可見部分細胞發(fā)出熒

12、光，熒光很弱，細胞形態(tài)無明顯改變，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，發(fā)出熒光的細胞數(shù)增多，熒光也隨之增強，處于細胞體的熒光較軸突強，有些細胞的熒光主要集中在細胞核周圍，轉(zhuǎn)染第5d，熒光數(shù)最多最強，連續(xù)培養(yǎng)14天，多數(shù)細胞胞體和突起的形態(tài)較正常無明顯改變。經(jīng)SGNs計數(shù)，非轉(zhuǎn)染組細胞減少明顯較轉(zhuǎn)染組顯著(P<0.05)。 4、重組腺病毒轉(zhuǎn)染三維離體培養(yǎng)的基底膜，第7天，基底膜上發(fā)出熒光的細胞數(shù)最多，熒光強度最強，綠色熒光蛋白的表達在螺旋神經(jīng)節(jié)

13、細胞、神經(jīng)纖維、毛細胞中最強；連續(xù)培養(yǎng)14天，基底膜上細胞的層次分明，組織結構沒有明顯改變，組織的有序性明顯高于非轉(zhuǎn)染組。 5、為了檢測β NGF對活體耳蝸和SGNs的保護作用，豚鼠隨機分成四組：病毒組A，慶大霉素組B，病毒組+慶大霉素組C，正常組D。通過圓窗膜將病毒液注入豚鼠耳蝸鼓階中，注射后以顳肌筋膜貼附在圓窗上，窗緣周圍用軟組織填塞以防病毒液滲漏。B組耳蝸內(nèi)不注射病毒液，每日肌注慶大霉素80mg/kg，連續(xù)10天。C組在耳

14、蝸注入病毒液后第三天每日肌注慶大霉素80mg/kg，連續(xù)10天。于感染后第10～12d處死動物，檢測各組豚鼠ABR聽閾值，處死后制備石蠟切片，甲苯胺藍染色觀察螺旋神經(jīng)節(jié)細胞尼氏小體形態(tài)和數(shù)目。在病毒組A中，ABR引出Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ波，Ⅲ波聽閾與正常無顯著性差異(p>0.05)。在慶大霉素的干預下，慶大霉素組腦干誘發(fā)電位無明顯波形引出；病毒組+慶大霉素組C有波形引出，但是聽閾值高于正常(p<0.05)。慶大霉素B組螺旋神經(jīng)節(jié)細胞尼氏小體多

15、數(shù)分解，病毒組+慶大霉素C組尼氏小體少數(shù)分解，大部分仍保持正常形態(tài)。 通過觀察β NGF在耳蝸不同發(fā)育階段的分布和量的變化，了解了β NGF在耳蝸不同發(fā)育階段中的地位和作用；成功構建了攜帶βNGF基因片段的腺病毒表達載體AD-βNGF；將病毒液轉(zhuǎn)染離體培養(yǎng)的SGNs和耳蝸基底膜，觀察β NGF對SGNs直接和間接的保護作用，為后續(xù)的研究打下了基礎；AD-β NGF成功感染了活體的耳蝸，感染范圍廣，未發(fā)現(xiàn)明顯的細胞毒性和炎性反應，