嗅鞘細(xì)胞對體外培養(yǎng)螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的作用及相關(guān)細(xì)胞因子和受體.pdf

1、第一部分 嗅鞘細(xì)胞的體外培養(yǎng)、純化和鑒定 目的：進(jìn)行嗅鞘細(xì)胞 (olfactory ensheathing cells，OECs) 的培養(yǎng)和純化，觀察其免疫熒光化學(xué)染色的表現(xiàn)，并計(jì)算OECs的培養(yǎng)純度，為下一步試驗(yàn)打下基礎(chǔ)。 方法：分離新生2天SD大鼠的嗅球，制成單細(xì)胞懸液，在含10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液(FBS組)、含1％N2的DMEM/F12培養(yǎng)液(N2組)、含1％B27的DMEM/F12培養(yǎng)液(B27組)

2、以及含1％N2和1％B27的DMEM/F12培養(yǎng)液(N2+B27組)中進(jìn)行培養(yǎng)，觀察OECs的生長狀態(tài)。采用多次長時(shí)差速貼壁法和低濃度胰酶快速消化法對 FBS組的OECs進(jìn)行純化并計(jì)算細(xì)胞純度，用p75NTR和GFAP進(jìn)行免疫細(xì)胞熒光化學(xué)染色，激光共聚焦顯微鏡觀察其染色特點(diǎn)。 結(jié)果： OECs在N2組、B27組和N2+B27組的三種無血清培養(yǎng)條件下難以存活，在FBS組的有血清培養(yǎng)條件下生長良好，主要污染細(xì)胞是成纖維細(xì)胞。采用多次

3、長時(shí)差速貼壁法和低濃度胰酶快速消化法可獲得較高的細(xì)胞純度，培養(yǎng)2周時(shí)細(xì)胞純度為89.4±7.3％，OECs聯(lián)合表達(dá)p75NTR(+)和GFAP(+)，p75NTR主要表達(dá)在胞體，GFAP在胞體和突起均有表達(dá)。 結(jié)論：目前OECs的體外培養(yǎng)仍為需血清培養(yǎng)，采用多次長時(shí)差速貼壁法和低濃度胰酶快速消化法可獲得高純度的OECs，本試驗(yàn)方法具有高度可重復(fù)性，為進(jìn)一步研究OECs對螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的作用奠定基礎(chǔ)。 第二部分 不同培養(yǎng)液

4、對體外培養(yǎng)螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的影響 目的：研究不同培養(yǎng)液對體外培養(yǎng)螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(spiral ganglion cells，SGCs)突起長度、細(xì)胞存活的影響，尋找更好的SGCs的培養(yǎng)方法。 方法：取新生2d的SD大鼠蝸軸螺旋管，進(jìn)行消化分離，制成單細(xì)胞懸液，分別采用含10％FBS的 DMEM/F12培養(yǎng)液(FBS組)、含1％N2的DMEM/F12培養(yǎng)液(N2組)、含1％B27的DMEM/F12培養(yǎng)液(B27組)以及含1％

5、N2和1％B27的DMEM/F12培養(yǎng)液(N2+B27組)培養(yǎng)2周，Neurofilement抗體行免疫細(xì)胞熒光化學(xué)染色，鑒定SGCs，并觀察不同培養(yǎng)條件下SGCs的突起長度、細(xì)胞數(shù)量的變化。 結(jié)果：FBS組和N2組在第5天達(dá)到最長突起長度，分別為 111.24±28.61μm和113.15±17.70μm；N2+B27組和B27組在第7天達(dá)到最大值，分別為184.26±30.06μm 和 193.50±29.1μm。前二組間和

6、后二組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，前二組與后二組間有非常顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。細(xì)胞數(shù)量均在第1 天最多，四組培養(yǎng)液中SGCs的細(xì)胞數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，之后呈下降趨勢。在FBS組和N2組中，細(xì)胞數(shù)量下降明顯，至第14天時(shí)，僅為7.07±2.55個(gè)/視野和4.34±2.63個(gè)/視野。而在N2+B27組和B27組中，細(xì)胞數(shù)量呈小幅減少，至14天時(shí)，仍可維持在115.60±16.33個(gè)/視野和117.8±15.52個(gè)

7、/視野。四種培養(yǎng)液中，F(xiàn)BS組和N2組間的細(xì)胞數(shù)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，N2+B27組和B27組間也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但后二者與前二者之間自第3天起有非常顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。 結(jié)論：采用含1％B27的DMEM/F12培養(yǎng)液或含1％N2和1％B27的DMEM/F12培養(yǎng)液進(jìn)行SGCs的體外培養(yǎng)，細(xì)胞存活數(shù)量多，生長狀態(tài)好。 第三部分 嗅鞘細(xì)胞對體外培養(yǎng)螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的作用 目的：研

8、究OECs對體外培養(yǎng)SGCs生長、凋亡和增殖的影響。 方法： OECs經(jīng)含10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)純化后，取嗅鞘細(xì)胞條件培養(yǎng)液(olfactory ensheathing cells conditioned medium，OECs CM)進(jìn)行SGCs的體外培養(yǎng)，同時(shí)取成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)液 (fibroblast conditioned medium，F(xiàn)BCM)和含10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液作為對照，Ne

9、urofilement免疫熒光化學(xué)染色觀察SGCs的生長，BrdU免疫熒光化學(xué)染色觀察SGCs的增殖，TUNEL原位末端標(biāo)記法觀察SGCs的凋亡。分別比較在OECs CM組、FB CM組和FBS組3種培養(yǎng)條件下，SGCs在第1、3、5、7天細(xì)胞數(shù)量、凋亡率和增殖的變化。 結(jié)果： OECs CM能夠維持較多的體外培養(yǎng)SCrCs的細(xì)胞數(shù)量，并降低SGCs的凋亡率。OECs CM與FB CM或含10％FBS的DMEM/F12相比較，對

10、SGCs細(xì)胞數(shù)量和凋亡率的影響有非常顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，而后二者之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。在OECs CM組第3天，發(fā)現(xiàn)少數(shù)SGCs發(fā)生增殖，其他時(shí)段及后二組的各個(gè)時(shí)段均未發(fā)現(xiàn)增殖的SGCs，OECs CM組第3天與其他時(shí)段及另二組各時(shí)段的細(xì)胞增殖數(shù)有非常顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)。 結(jié)論： OECs CM能夠維持較多的體外培養(yǎng)SGCs的數(shù)量，這種現(xiàn)象可能通過抑制SGCs的凋亡來實(shí)現(xiàn)。OECs CM

11、可促進(jìn)SGCs的增殖。 第四部分 參與嗅鞘細(xì)胞對螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞作用的細(xì)胞因子和受體 目的：對OECs可能分泌的細(xì)胞因子和SGCs可能存在的細(xì)胞因子受體進(jìn)行RT-PCR,初步分析OECs可能通過哪些細(xì)胞因子和受體參與促進(jìn)SGCs存活和增殖，抑制SGCs凋亡的作用。 方法：分別對嗅球、培養(yǎng)的OECs和FB進(jìn)行組織和細(xì)胞總RNA的抽提，cDNA的合成以及Laminin、NCAM、BMP-4、BMP-7、CNTF和bFG

12、F等細(xì)胞因子的PCR反應(yīng)；對耳蝸和SGCs進(jìn)行α7 integrin、αV integrin、BMPR-1A、BMPR-1B、BMPR-Ⅱ、CNTFR和FGFR-1等細(xì)胞因子受體的RT-PCR反應(yīng)，觀察各細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體mRNA的表達(dá)情況，根據(jù)嗅球、OECs表達(dá)的細(xì)胞因子和耳蝸、SGCs表達(dá)的受體的一致性判斷哪些細(xì)胞因子和受體參與作用。 結(jié)果：嗅球和OECs對上述細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平基本一致，均表達(dá)NCAM、BMP-4，OB