輸入供體凋亡細(xì)胞對(duì)受體外周血細(xì)胞因子的影響.pdf

1、目前，原位肝移植（Orthotopic liver transplantation，OLT）是治療終末期肝病最有效和常規(guī)措施。然而，盡管由于外科技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化、免疫抑制劑的不斷研發(fā)和應(yīng)用，移植物的長(zhǎng)期存活率沒(méi)有明顯提高。器官移植術(shù)后的排斥反應(yīng)仍是威脅患者和移植物長(zhǎng)期存活的主要原因。免疫抑制劑的應(yīng)用，不僅使器官移植成為終末期腎、肝、心臟疾病可接受的治療方式，而且顯著減少了急性排斥的發(fā)生率，同時(shí)顯著提高了器官移植病人的短期、長(zhǎng)期生存率。然而，

2、免疫抑制劑的應(yīng)用帶來(lái)了許多問(wèn)題。首先，要終身連續(xù)對(duì)免疫系統(tǒng)進(jìn)行非特異性免疫抑制。第二，當(dāng)前使用的免疫抑制劑中，沒(méi)有一種能完全預(yù)防急性排斥或者慢性排斥。第三，免疫抑制劑的應(yīng)用帶來(lái)了腫瘤和感染的風(fēng)險(xiǎn)。第四，免疫抑制劑的應(yīng)用增加了移植病人高血壓的風(fēng)險(xiǎn)以及由此導(dǎo)致的心血管并發(fā)癥。因此，誘導(dǎo)受者對(duì)供者器官特異性免疫耐受是解決排斥反應(yīng)最理想的措施，相對(duì)免疫抑制療法，誘導(dǎo)免疫耐受的優(yōu)勢(shì)是從根本上避免了排斥反應(yīng)，又不影響機(jī)體的正?？垢腥竞兔庖弑O(jiān)視功能，

3、同時(shí)避免了藥物毒性。而且，耐受的誘導(dǎo)對(duì)于最終克服異種移植免疫學(xué)障礙也許是最佳途徑，因?yàn)楫惙N移植免疫抑制需長(zhǎng)期高水平的、非特異性的免疫抑制劑來(lái)維持。因此，誘導(dǎo)移植免疫耐受性，控制移植物排斥反應(yīng)，保護(hù)移植器官的功能，這無(wú)論在同種移植和異種移植中都是十分重要的課題。 由于移植免疫耐受的機(jī)制十分復(fù)雜，盡管誘導(dǎo)免疫耐受的方法眾多，但均未能達(dá)到完全可靠持久的特異性耐受。細(xì)胞凋亡是生物體內(nèi)普遍存在的一種生理和病理現(xiàn)象，是正常器官和組織發(fā)育、清

4、除有害的、過(guò)量的和無(wú)功能細(xì)胞、維持自身穩(wěn)態(tài)的必要環(huán)節(jié)?，F(xiàn)有研究表明：凋亡是機(jī)體免疫狀態(tài)保持平衡和穩(wěn)定的重要作用機(jī)制，凋亡細(xì)胞對(duì)免疫系統(tǒng)存在著主動(dòng)的調(diào)節(jié)作用。凋亡細(xì)胞能分泌脂類(lèi)趨化因子，改變自身胞膜結(jié)構(gòu)表達(dá)“eat-me”信號(hào)，誘導(dǎo)吞噬細(xì)胞對(duì)其進(jìn)行清除；同時(shí)凋亡細(xì)胞被抗原提呈細(xì)胞吞噬后，通過(guò)吞噬細(xì)胞分泌抑制性免疫因子如TGF-β、PGE2、IL-10等，造成了特殊的抗原識(shí)別微環(huán)境，可以促使相關(guān)淋巴細(xì)胞針對(duì)凋亡抗原產(chǎn)生免疫耐受，而不會(huì)引起炎

5、性免疫應(yīng)答。據(jù)此，孫爾維等提出利用供體凋亡細(xì)胞輸注受體誘導(dǎo)供體特異性免疫耐受的理論設(shè)想。 細(xì)胞因子是活化細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞間信號(hào)多肽.大多數(shù)細(xì)胞因子都有多種來(lái)源，多種作用靶位和多種功效.細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)是參與免疫識(shí)別、應(yīng)答反應(yīng)的重要成分，也是決定免疫反應(yīng)發(fā)生方向的主要因素之一。抗原性物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體后引起免疫系統(tǒng)發(fā)生的各種反應(yīng)變化中包括了細(xì)胞因子比例水平的改變，由于后者直接參與前者的發(fā)生過(guò)程與最后結(jié)果表現(xiàn)，從而探討細(xì)胞因子的變現(xiàn)表現(xiàn)對(duì)分析以

6、及預(yù)測(cè)免疫反應(yīng)發(fā)生和走向有一定的意義。 我們課題組以前的工作證實(shí)，一定數(shù)量的供體凋亡脾淋巴細(xì)胞預(yù)輸注可以誘導(dǎo)大鼠心、肝臟移植模型產(chǎn)生特異性免疫耐受，延長(zhǎng)移植存活的時(shí)間。且通過(guò)對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行示蹤實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)凋亡的脾淋巴細(xì)胞主要聚集并駐留于肝臟，且對(duì)肝臟組織的細(xì)胞因子的微環(huán)境產(chǎn)生了影響。但輸入的過(guò)程中是否也影響外周的細(xì)胞因子微環(huán)境，這對(duì)下部進(jìn)一步探討誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制有重要的影響。所以本實(shí)驗(yàn)主要在前期的基礎(chǔ)上，對(duì)供體凋亡脾淋巴細(xì)胞預(yù)輸注是

7、否影響外周血微環(huán)境進(jìn)行研究。 目的: 已知凋亡細(xì)胞發(fā)生免疫調(diào)節(jié)作用時(shí)也會(huì)同時(shí)伴有細(xì)胞因子等微環(huán)境的變化。且前期工作證明供體凋亡脾淋巴細(xì)胞輸注對(duì)受體肝臟內(nèi)細(xì)胞因子微環(huán)境有影響，本部分對(duì)供體凋亡細(xì)胞輸注后對(duì)外周血免疫微環(huán)境中一系列重要細(xì)胞因子的變化進(jìn)行觀(guān)察，以了解供體凋亡脾淋巴細(xì)胞輸注對(duì)外周血細(xì)胞因子的影響。 方法: 供體C57BL小鼠14只，8-10周，雄性；受體Balb/c小鼠6-8周，50只，雄性。具體

8、如下： （1）機(jī)械研磨法分離脾臟細(xì)胞，易得分離液分離淋巴細(xì)胞。 （2）紫外線(xiàn)照射法誘導(dǎo)凋亡，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。 （3）采用尾靜脈輸入法，每處理組每時(shí)間點(diǎn)5只小鼠，預(yù)輸注處理分組：供體脾臟活細(xì)胞處理組（Liver cell treatment group，LG），供體脾臟凋亡細(xì)胞處理組（Apoptotic cell treatment group，AG）： （4）檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)：輸注后0h、1h、3h、

9、6h、12h； （5）采用體外心臟采血法，收集樣本； （6）Luminex技術(shù)液態(tài)芯片法檢測(cè)外周血IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、GM-CSF（粒細(xì)胞-巨細(xì)胞激落刺激因子）、IFN-γ、TNF（腫瘤壞死因子）； （7）所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS13.0和GraphPad PRISM3.02等軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和作圖。 結(jié)論: 本實(shí)驗(yàn)證明凋亡細(xì)胞組和活細(xì)胞組

10、相比，外周IL-6在1h時(shí)有顯著性差異和IL-10在3h、6h和12h時(shí)存在顯著性差異，活細(xì)胞組高于凋亡細(xì)胞組，其他細(xì)胞因子都無(wú)顯著性差異，而且活細(xì)胞輸注后，3h、6h的IL-10濃度明顯高于0h。凋亡細(xì)胞輸注后對(duì)細(xì)胞因子基本無(wú)改變，從IL-6和IL-10的結(jié)果我們可以推測(cè)：活細(xì)胞輸注后，機(jī)體產(chǎn)生了急性炎性反應(yīng)，使IL-6于1h時(shí)升高，而3小時(shí)后，機(jī)體為了避免炎性反應(yīng)過(guò)度而采取了保護(hù)措施，增加IL-10的分泌，阻斷了單核、巨噬細(xì)胞合成I

11、L-6、TNFα等介質(zhì)，而凋亡細(xì)胞對(duì)機(jī)體外周血無(wú)明顯的作用，根據(jù)凋亡細(xì)胞是一種死細(xì)胞，具有完整的包膜，在組織中的清理主要為吞噬作用，可能相對(duì)于異種的活細(xì)胞引起的炎性反應(yīng)作用較弱。凋亡細(xì)胞輸入后，對(duì)外周血中GM-CFS濃度在3h時(shí)明顯升高和活細(xì)胞輸入后，6h時(shí)對(duì)外周血中IFN-γ濃度的影響有顯著性意義，具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。而根據(jù)以往的研究，凋亡細(xì)胞對(duì)機(jī)體有明確的作用，可以引起免疫耐受的，而且本課題組的前期研究通過(guò)對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行示蹤實(shí)