細(xì)胞因子對(duì)外周血樹突狀細(xì)胞的體外誘導(dǎo)成熟及其功能影響.pdf

1、[目的]選用幾種不同的細(xì)胞因子組合，體外培養(yǎng)人外周血單個(gè)核細(xì)胞，誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞(dendriticcells，DCs)產(chǎn)生，并檢測(cè)其表面分子的表達(dá)及刺激同種異體T淋巴細(xì)胞增殖的功能，從而建立誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞的最佳實(shí)驗(yàn)方法。并探討細(xì)胞因子對(duì)DCs體外誘導(dǎo)、成熟及其功能的影響。 [方法]無菌采集健康人外周血，肝素鈉抗凝，采用密度梯度離心的方法獲得單拿核細(xì)胞，用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基在24孔板上貼壁培養(yǎng)2小時(shí)，棄去末貼

2、壁細(xì)胞，即獲得貼壁細(xì)胞，在24孔板上用含以下6組不同細(xì)胞因子的RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)①對(duì)照組：不加細(xì)胞因子②rhGM-CSF/rhIL-4③rhGM-CSF/rhIL-4/PHA④rhGM-CSF/rhIL-13⑤rhGM-CSFrhIL-13/PHA⑥PHA，各種因子加入的劑量分別為(在培養(yǎng)液中的最終濃度)：rhGM-CSF(50ng/ml)、rhIL-4(40ng/ml)、rhIL-13(40ng/ml)、PHA(50μg/

3、ml)，觀察DC的生成及免疫表型的表達(dá)情況。6天后，分別在各組中加入LPS、IL-2、TNF-α等促成熟因子誘導(dǎo)DC成熟,加入的劑量分別為：LPS(20ng/ml)、IL-2(5ng/ml)、TNF-α(20ng/ml)鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)3，6，9天細(xì)胞CD1a、CD83、CD86、CD209表達(dá)：MTT法檢測(cè)誘導(dǎo)培養(yǎng)的DC體外刺激同種異體T淋巴細(xì)胞增殖的活性，比較各成熟因子對(duì)DC作用的影響。 [結(jié)果]1、經(jīng)不

4、同的細(xì)胞因子誘導(dǎo)培養(yǎng)6天后，倒置顯微鏡下可見多數(shù)細(xì)胞呈懸浮生長，細(xì)胞胞體較大，細(xì)胞表面可見有不規(guī)則突起。2、在IL-4、GM-CSF組合中加入刺激齊劑TNF-α、LPS或IL-2后，DC表面CD1a、CD83、CD86、CD209表達(dá)明顯升高，其刺激同種異體T淋巴細(xì)胞的能力明顯增強(qiáng)，刺激細(xì)胞/反應(yīng)細(xì)胞為1∶10時(shí)刺激T細(xì)胞增殖能力最明顯。在各組中，尤以TNF-α、LPS和IL-2同時(shí)加入組誘導(dǎo)培養(yǎng)的DC免疫表型表達(dá)率最高，CD1a、CD

5、83、CD86、CD209表達(dá)率分別是：50.2％，48.2％，77.4％，64.3％，刺激T細(xì)胞增殖能力最明顯。3、IL-4、GM-CSF組合與IL-13、GM-CSF組合組培養(yǎng)誘導(dǎo)的DC在成熟和功能方面未見有明顯的差異。4、在細(xì)胞因子的組合方案中加入PHA后，可看到細(xì)胞聚集成團(tuán)明顯，細(xì)胞免疫表型的表達(dá)率增高，但單獨(dú)加入PHA未能誘導(dǎo)出DC。 [結(jié)論]幾種不同的細(xì)胞因子組合都能從健康成人外周血單個(gè)核細(xì)胞體外誘導(dǎo)出DC，但單純I

6、L-4、GM-CSF組合與IL-13、GM-CSF組合組培養(yǎng)誘導(dǎo)的DC多為不成熟的DC，加入刺激劑TNF-α、LPS或IL-2后，特別是TNF-α、LPS和IL-2同時(shí)加入組誘導(dǎo)的DC表面CD1a、CD83、CD86、CD209表達(dá)增加，在形態(tài)及功能上具有典型成熟DC的特點(diǎn)。 [意義]探討了幾種不同的細(xì)胞因子組合培養(yǎng)誘導(dǎo)人PBMC成DC的方法并在各方法間進(jìn)行了比較，為尋找一種簡(jiǎn)單、有效、經(jīng)濟(jì)的誘導(dǎo)培養(yǎng)功能性DC的方法提供了新的實(shí)