pcv2對(duì)體外培養(yǎng)仔豬脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的動(dòng)態(tài)影響

1、· 5 8 ·A n i ma lHu s b a n d r y＆ Ve t e r i n a r yMe d i c i n e2 0 0 9Vo 1 ． 41N o ． 9鴦 一{留 薯。 = 奠銎j=霧 0jl l l。P C V 2 對(duì)體外培養(yǎng) 仔豬脾細(xì)胞分泌細(xì) 胞 因子 的 動(dòng) 態(tài) 影 響 陳耿 ，趙 焱 ，包 銀莉 ，孟玲玲 ，田忠 園，李桂平 ，華利 忠 ，張書霞( 南京農(nóng) 業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ，

2、江蘇 南京 2 1 0 0 9 5 )摘要 ：為進(jìn)一步了解豬圓環(huán)病毒2 型 ( P C V 2 )引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的機(jī)理，選取 5 頭3 5日 齡 P c v 2 血清抗體陰性的斷奶仔豬 ， 無(wú)菌 取脾臟制成單個(gè) 細(xì)胞懸液 ，體外培養(yǎng) ，分 P C V 2感染組 與對(duì)照組 。分別在培養(yǎng)后 0h 、 6h 、1 2h 、 2 4h收獲細(xì)胞培養(yǎng)上 清，用 豬特異性 E L I S A試 劑盒測(cè)定上清中自細(xì)胞介素- 1 p ( I

3、 L ． i p ) 、腫瘤壞死因子． O t( T N F - a ) 、白細(xì)胞介素 6 ( I L - 6 )和 白細(xì)胞介素 1 O ( I L 一 1 0 )的含量。結(jié)果顯示 ： 病 毒 組 I L - 1 B和 I L - 6 在不 同時(shí)間點(diǎn)的含量變化均不 顯著 ( P > 0 ． 0 5 ) ，I L 一 1 B 在 6h 、 2 4h 略高于對(duì)照組 ，1 2h 則低于對(duì) 照組 ；1 L 一 6除在 6h高于對(duì) 照組 外

4、 。其余時(shí)間點(diǎn)均低 于對(duì)照組 ；病毒組 T N F — a和 I L — l 0的含量在 6h 、1 2h 、2 4h 均高于對(duì)照組 ，且 T N F -在 6h 和 2 4h 極顯著升高 ( P < 0 ． O 1 ) ，而 I L 一 1 O 在 1 2h 顯著高于對(duì)照組 ( P < 0 ． 0 5 ) 。上述結(jié) 果表明：P C V 2 能影 響體外培養(yǎng) 的仔豬脾 細(xì)胞某些細(xì)胞 因子的分泌 ，而且可能通過(guò) T N F -

5、 d的 高表達(dá)促使機(jī)體產(chǎn)生全 身炎癥反應(yīng)綜合征甚至多系統(tǒng) 衰竭 ，而通過(guò) I L — l O 的高表達(dá)促使機(jī)體產(chǎn)生免疫抑制 。關(guān)鍵詞 ：豬圓環(huán)病毒2型；仔豬； 脾細(xì)胞；細(xì)胞因子 中圖分類號(hào) ：$ 8 5 2 ． 6文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ： A文章編號(hào) ： 0 5 2 9 - 5 1 3 0 ( 2 0 0 9 ) 0 9 — 0 0 5 8 — 0 3豬 圓環(huán)病毒 2型 ( P o r c i n ec i r c o v i m s ，P C

6、V 2 )是 一 種小的無(wú)囊膜單股環(huán)狀 D N A病毒 ，普遍認(rèn)為它是 斷奶仔 豬多 系統(tǒng)衰 竭綜合 征 ( P o s t w e a n i n gM u l t i s y s -t e m i cWa s t i n gS y n d r o m e ， P MWS ) 的主 要 病 原 。這 種 疾病 1 9 9 1 年在加拿大西部首次發(fā)現(xiàn)之后 ，目前世界 各地都有報(bào)道。P M WS 豬主要以進(jìn)行性消瘦 、全身淋 巴結(jié)腫大 、

7、呼吸困難為主要特征 ，有些病例還有皮膚 蒼白、黃疸和腹瀉。其主要的組織病理學(xué)變化包括 ：淋巴細(xì)胞缺失¨J 、間質(zhì)性肺炎 、肝 炎等。P C V 2的 抗原和核酸在 P M WS 豬 的很多種不 同類 型的細(xì)胞 中都能檢測(cè)到，但 以單核／ 巨噬細(xì)胞及單核／ 巨噬細(xì)胞系的其他細(xì)胞最普遍 ，有時(shí)在 自然發(fā)病豬的 B 、T淋 巴細(xì)胞 中也能檢測(cè)到 。自然發(fā)病 的 P M WS豬淋 巴組織 表現(xiàn) 出嚴(yán)重的全身性 的淋巴細(xì)胞凋亡。有些研究

8、表明 P M WS 豬存在淋 巴細(xì)胞 的缺失并 且其血 液 中 C D、C D、I g M等淋巴細(xì)胞亞群的 比例發(fā)生變化。目前，對(duì)臨床發(fā)生 P M WS 和 P C V 2 亞臨床感染豬各免疫器官 和血清中相關(guān)細(xì)胞 因子 的研究較多 j ，有些文獻(xiàn)還 對(duì) P M WS豬 外 周 血 單 個(gè) 核 細(xì) 胞 ( p e r i p h e r a lb l o o dm o n o n u c l e a rc e l l s ， P B M

9、 C )對(duì) P C V 2的再 次應(yīng)答時(shí)相 關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)變化進(jìn)行 了研究。 。，然而 P C V 2對(duì) 仔豬脾細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子分泌的影響如何 ，特別是在 收稿 E t 期 ： 2 0 0 9 — 0 3 — 2 6基金項(xiàng) 目：國(guó)家 自然 科學(xué) 基金 ( 3 0 4 7 1 3 0 2 ；3 0 8 7 1 8 4 8 ) ；南 京農(nóng) 業(yè)大學(xué) S R T 計(jì)劃 ( 0 7 0 4 A 1 2 ) 。作者簡(jiǎn)介 ：陳耿 ( 1 9 8 4

10、 一) ，男 ，碩士研究生。通訊作者。病毒作用后細(xì)胞因子的動(dòng)態(tài)變化尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn) 主要研究 P C V 2 對(duì)體外培養(yǎng)的仔豬脾細(xì)胞分泌 I L 一 11 3 、I L 一 6 、I L ． 1 0 、T N F ． o t 等細(xì)胞 因子 的動(dòng)態(tài) 變化 ，探討 P C V 2 引起 P M WS 發(fā)生和仔豬免疫功能變化 的動(dòng)態(tài)過(guò) 程 ，為防治該病提供理論依據(jù)。1 材料與方法 l - 1 病 毒 P C V 2 ． 上海株 ( P C

11、V 2 ． S H)由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè) 部動(dòng)物疫病診斷與免疫重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室提供 ，通過(guò)間接免疫 熒光 試驗(yàn) 及 P C R測(cè) 定 ，病 毒滴 度為 5 × 1 0TCI D5 o ／mL。1 - 2 主 要試劑 豬 I L ． 11 3 、I L 一 6 、 I L 一 1 0 特異性酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè) ( E L I S A )試劑盒購(gòu) 自 美 國(guó) A D L公司；豬特異性 T N F —o 【 E L I S A 試 劑 盒

12、 購(gòu) 于 晶美 公 司；蛋 白酶 K 購(gòu) 自M E R K E公司 ； R P M I 1 6 4 0培養(yǎng)基購(gòu) 自G i b c o 公司 ；酶 標(biāo)儀 ( S y n e r g y 2 )為美國(guó) B i o t e k 公 司產(chǎn)品 ；臺(tái)式離心 機(jī) ( T G L 一 1 6 C型，上海安亭科學(xué)儀器廠 ) ；恒溫水浴 鍋 ( H H 一 6型 ，國(guó)華電器有限公司)等。1 ． 3 試 驗(yàn)設(shè) 計(jì) 5頭3 5日 齡經(jīng) E L I S A法檢測(cè)

13、血清 P C V 2 和豬繁殖 與呼吸綜合征病毒 ( P R R S V)抗體 陰性 的普通斷奶 健康仔豬購(gòu) 自江蘇省盱眙縣 。隔離飼喂 3d 后 ，頸靜 脈放血 致 死 ，無(wú) 菌摘 取 脾 臟 ，機(jī) 械 法 分 離，用 含 1 0 ％小 牛血清的 R P M I - 1 6 4 0培養(yǎng)液制成單個(gè)細(xì)胞懸 液 ，調(diào)整細(xì)胞濃度為 6 x 1 0~ “ ／ m L ，分為對(duì)照組和病 · 6 0·An i ma lHu s

14、b a n d r y& Ve t e r i n a r y Me d i c i n e2 0 0 9Vo 1 ． 4 1N o ． 93 討論 I L ． 1B 、I L 一 6作為炎癥反應(yīng) 的重要介質(zhì)，具有多 種免疫調(diào)節(jié)功能 ，包括參與機(jī)體的防御和促進(jìn)全身反 應(yīng)性炎癥等 J 。本試驗(yàn) 中 I L - 1 8和 I L 一 6含量 的變化 趨勢(shì)比較一致 。在接種 P C V 2后 6h ，病毒組 中二者 的含量均比對(duì)照

15、組高 ，而在 1 2h和 2 4h病毒組 中 I L -6的含量均低于對(duì)照組 ，且病毒組 I L 一 1B的含量在 l 2h 低于對(duì)照組 ， 2 4h又恢復(fù)到正常水平。I L 一 1 1 3 和 I L -6的這種變化情況 與 S i p o s的研究 結(jié)果是一致 的 J 。試驗(yàn)中分離脾細(xì)胞的方法并不能將脾臟 中存在的巨噬 細(xì)胞分離去除，故在我們分離的脾細(xì)胞 中除含有大量 的淋巴細(xì)胞外 ，還含有一定量的巨噬細(xì)胞。在脾臟免 疫細(xì)胞 的組

16、成中，9 0 ％為淋 巴細(xì)胞 ( T細(xì)胞 3 5 ％ ，B細(xì)胞約占5 5 ％) ，另約 1 0 ％為巨噬細(xì)胞 。P C V 2的 抗原與核酸主要存在于單核／ 巨噬細(xì)胞 內(nèi)，且上皮 與 內(nèi)皮細(xì)胞很 可能是 病毒 增殖 的主要 場(chǎng)所 。因而 ，病毒在單核／ 巨噬細(xì)胞系的細(xì)胞和其他抗原提呈細(xì)胞 中的寄生與復(fù)制 ，可能對(duì)這些細(xì)胞合成與分泌 I L 一 1B和 I L 一 6 產(chǎn)生較大影響。提示 P C V 2可能通過(guò)影 響其 相應(yīng)宿主細(xì)胞的生理

17、代謝 ，改變細(xì)胞因子表達(dá)進(jìn)而影 響機(jī)體的免疫 應(yīng)答。細(xì)胞培養(yǎng) 上清 中 I L ． 1p和 I L - 6在 P C V 2作用的早期有輕微的升高 ，這可能 為單核／巨噬細(xì)胞系的活化提供了某些證據(jù) ，而在 P C V 2作用 的后期 ，I L 一 1 1 3和 I L 一 6又出現(xiàn)下降 ，提示單核／ 巨噬 細(xì)胞系的活性在 P C V 2 作用的后期受 到了抑制。這與 機(jī)體在針對(duì)多種病原體 的免疫 應(yīng)答 中的特 點(diǎn)是一致 的，即在感染 的

18、早期能激活機(jī)體的免疫應(yīng)答 ，而在感 染的后期能抑制機(jī)體的免疫應(yīng)答¨。接種 P C V 2 后的所有時(shí)間點(diǎn) ，病毒組 T N F - 儀的含 量始終 高 于對(duì) 照組 ，這 與 S i p o s的 報(bào)道 不 一 致 。T N F 一 儀作為一種主要 由單核／ 巨噬細(xì)胞產(chǎn)生 的重要早 期促炎因子和免疫調(diào)節(jié) 因子 ，其含量始終處于高水平 表達(dá) ，在增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答 的同時(shí) ，也能造成多種組 織的損傷 ，提示 P C V 2可能通過(guò)上

19、調(diào) T N F — O f ． 的表 達(dá) ，進(jìn)而導(dǎo)致 多種組織的損傷 ，甚至 出現(xiàn) P M WS的 臨床癥狀 ，即 P C V 2引起 P M WS 很可能與該病毒能引起感染豬持續(xù) 高水平 表達(dá) T N F ． O t 有關(guān)。有趣 的是 在 促使機(jī)體發(fā)生免疫抑制 中起重要作用 的 I L ． 1 0 ，在接 種 P C V 2 后 的所有時(shí)間點(diǎn) ，其在病毒組中的含量均高 于對(duì)照組 ，特別是在攻毒后的 1 2h ，病毒組細(xì)胞培養(yǎng) 上清 中

20、 I L — l O的含量要顯著高于對(duì)照組。這與很多文 獻(xiàn)報(bào)道在 自然發(fā)病 的 P M WS病例免疫器官或組織 中I L — l 0的含量升高是一致 的 ，提示 P C V 2能通過(guò)上 調(diào) I L - l 0的表達(dá)而使機(jī)體產(chǎn)生免疫抑制。本試驗(yàn)中我們選取 4 種在炎癥發(fā)生發(fā)展 中扮演重 要角色 的細(xì)胞因子為研究對(duì)象，以期探討 P C V 2的致 病機(jī)理 。結(jié)果發(fā)現(xiàn) P C v 2能引起體外培養(yǎng)的仔豬脾細(xì) 胞在表達(dá)這些細(xì)胞因子中發(fā)生有規(guī)律的

21、變化，特別是 對(duì) I L ． 6 、T N F ． O t 、I L ． 1 0的影 響較大。這種 變化提示 病毒可能通過(guò)刺激炎癥反應(yīng)而發(fā)揮作用。這也能夠解 釋為什么在 P C V 2 感染豬中能觀察到典型的肉芽腫性 損傷。這種機(jī)制能夠促使 巨噬細(xì)胞趨化到感染部位 ，因而也增加 了病毒找到新靶細(xì)胞的機(jī)會(huì)。參考文獻(xiàn) ：韓惠利 ，張書霞 ， 施旅娟． P C V 2對(duì)體外 培養(yǎng)仔 豬淋 巴細(xì)胞凋 亡的影響 [ J ] ．南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) ，

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23、p r o f i l ei nf e e d e rp i g ss u f f e r in gf r o m n a t u r a lp o s t we a n i n gmu h i s y s t e mi ew a s t i n gs y n d r o me( P MWS)a sd e t e r m i n e db ys e mi q u a n t i t a t i v eR T -P C Ra n df

24、l o wc y t o m e t r i ci n t r a c e l l u l a rc y t o k i n ed e t e c t i o n [ J ] ． V e t —e r i n a r yI mmu n o l o g ya n dI mmu n o p a t h o l o g y ，2 0 0 4，9 9：6 3 - 71 ．Da r wi c hL，Pi eS，Ro v i r aA，e ta 1

25、 ．Cy t o k i n emRNA e x p r e s s i o np r o —f i l e si nl y mp h o i dt i s s u e so fp i g sn a t u r a l l ya f f e c t e db yp o s t we a n i n gm u h i s y s t e m i cw a s t i n gs y n d r o m e[ J ] ．J o u ma l

26、o fG e n e r a lV i r o l o g y，2 0 03，8 4：21 1 7 - 2 1 2 5．D a r w i c hL ，S e g a leSJ ， R e s e n d e sA ， e ta 1 ． T r a n s i e n tc o r r e l a t i o nb e —t we e nv i r e mi al e v e l sa n dI L - 1 0e x p r e s s

27、 i o ni np i g ss u b c l i n i c a ll yi n f e c · -t e dw i t hp o r c i n ec i r c o v i r u st y p e2( P C V 2 ) [ J ] ． R e s e a r c hi nV e t e r -i n a r yS c i e n c e ，2 0 0 8，8 4：1 9 4- 1 9 8 ．D a r w i e

28、 hL ，B a l a s c hM，P l a n a · D u r a nJ ，e ta 1． C y t o k i n ep r o f i l e so fp e r i p h e r a l b l o o dmo n o n u c l e a rc e i l sf r o m p i g swi t hp o s t we a n i n gmu l t i —s y s t e mi cwa s

29、 t i n gs y n d r o mei nr e s p o n s et omi t o g e n，s u p e r a n t i g e no rr e c a l lv i r a la n t i g e n s[ J ] ． J o u r n a lo fG e n e r a lV i r o l o g y， 2 0 0 3 ， 8 4 ：3 4 5 3 - 3 4 5 7．楊 漢 春． 動(dòng) 物 免 疫 學(xué)

30、 [ M] ． 北 京 ：中 國(guó) 農(nóng) 業(yè) 出 版 社 ，2 0 0 3：3．李 大 金． 生 殖 免 疫 學(xué) [ M] _ 上 海 ：復(fù) 旦 大 學(xué) 出 版 社 ，2 0 0 8：7．Pe r e z ． Ma r tI nE，Ro v i r aA ，Ca l s a mi g l i aM ，e ta 1 ．A n e wme t h o dt oi d e n t i ~c e l lt y p e st h a ts u p

31、p o ~p o r c i n ee i r c o v i r u st y p e2r e p l i c a t i o ni nf o r m a l i n ． f i x e d 。 p a r a f f i n — e m b e d d e ds w i n et i s s u e s[ J ] ．J o u r n a lo fVi r o l o g i c a lMe t h o d s ，2 0 0 7：6