1-3-β-葡聚糖對(duì)體外共培養(yǎng)巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞Th細(xì)胞因子分泌的影響.pdf

1、前言:
　　 有機(jī)粉塵是指在空氣中漂浮的有機(jī)物顆粒,包括植物、動(dòng)物和微生物源性的顆粒和微滴。在自然界尤其是生產(chǎn)加工過程中廣泛受到有機(jī)粉塵的污染。細(xì)菌或真菌及其產(chǎn)生的內(nèi)毒素、1-3-β-葡聚糖、真菌孢子、動(dòng)物蛋白等可以引起許多呼吸道炎癥或過敏性疾病,如職業(yè)性變態(tài)反應(yīng)性肺泡炎(occupationalal lergic alveolitis)、有機(jī)粉塵毒性綜合征等。職業(yè)性變態(tài)反應(yīng)性肺泡炎是由于吸入被真菌、細(xì)菌或動(dòng)物蛋白污染的有機(jī)粉塵

2、而引起的間質(zhì)肉芽腫性肺炎,也稱過敏性肺炎。真菌是主要致病因子之一。1-3-β-葡聚糖是真菌細(xì)胞壁的主要結(jié)構(gòu),作為研究真菌致病性的標(biāo)志物。
　　 細(xì)胞因子(cytokine)由多種細(xì)胞分泌,相互促進(jìn)或相互抑制,發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。1-3-β-葡聚糖與吞噬細(xì)胞膜表面受體結(jié)合,引起細(xì)胞因子的分泌。
　　 Th1和Th2細(xì)胞都有其特有的細(xì)胞因子。白細(xì)胞介素-2(interleukin-2,IL-2)與γ-干擾素(［γ-inter

3、feron,IFN-γ)是代表性的Th1型細(xì)胞因子。白細(xì)胞介素4(interleukin4,IL-4)是代表性的Th2型細(xì)胞因子。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)1-3-β-葡聚糖可以影響Th1型免疫應(yīng)答。如1-3-β-葡聚糖可促進(jìn)IFN-γ上調(diào)TNF-α,IL-6和IL-1βmRNAs的表達(dá)和分泌。1-3-β-葡聚糖也可影響Th2型免疫應(yīng)答。Th1和Th2型細(xì)胞因子發(fā)揮不同作用,以致對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不同的功能影響。1-3-β-葡聚糖可能是通過誘導(dǎo)白細(xì)胞介素1

4、0(interleukin10,IL-10)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)的表達(dá)或分泌抑制Th1型免疫應(yīng)答。
　　 為研究1-3-β-葡聚糖對(duì)Th型細(xì)胞因子分泌的影響,本實(shí)驗(yàn)同時(shí)分離并體外共同培養(yǎng)肺泡巨噬細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞。RealtimeRT-PCR檢測(cè)調(diào)節(jié)性淋巴細(xì)胞標(biāo)志物Foxp3mRNA表達(dá)水平觀察是否誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分化,從而調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌情況。采用EIASA方法測(cè)上清液中Th型細(xì)胞因子及抑制性因子的分泌情況。
　　

5、 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 一、小鼠1-3-β-葡聚糖體內(nèi)灌注
　　 C57BL/6小鼠(6-8w齡,雌性)應(yīng)用非暴露式氣管灌注0.1ml1-3-β-葡聚糖(3mg/ml)或0.1mlPBS建立C57BL/6小鼠肺部炎癥模型組和陰性對(duì)照組。
　　 二、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的分離
　　 氣管灌注7天后處死模型組和對(duì)照組小鼠。將肺臟從小鼠體內(nèi)游離并得到肺泡灌洗液(Broncho alveolarlavagefluid

6、,BALF),BALF1500r/min,4℃,離心10分鐘,收集細(xì)胞懸液,取10ul細(xì)胞懸液至于細(xì)胞計(jì)數(shù)板上,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。細(xì)胞數(shù)=(四個(gè)大格的細(xì)胞總數(shù)/4)×104。用含有10%胎牛血清的RPMI-1640將細(xì)胞濃度調(diào)整到1×105/ml。用24孔板進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。對(duì)照組及模型組小鼠的BALF細(xì)胞各加1ml到4個(gè)培養(yǎng)孔。24孔板置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱。貼壁培養(yǎng)2小時(shí),RPMI-1640清除未貼壁細(xì)胞,得到純度較高的巨噬細(xì)胞。將脾

7、臟從小鼠體內(nèi)游離,放置到35mm培養(yǎng)皿中加淋巴細(xì)胞分離液研磨。收集細(xì)胞于離心管,加200-500μlRPMI-1640。2000r/min,4℃離心30分鐘。吸取淋巴細(xì)胞于新的離心管并加培養(yǎng)基離心洗滌并重懸。取10ul細(xì)胞懸液于細(xì)胞計(jì)數(shù)板上,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),將細(xì)胞濃度調(diào)整到5×106/ml備用。
　　 三、體外共培養(yǎng)
　　 對(duì)照組、模型組巨噬細(xì)胞及對(duì)照組、模型組淋巴細(xì)胞體外分別混合培養(yǎng),細(xì)胞置于24孔板加體外刺激因素1-3

8、-β-葡聚糖(100μg/ml)或PBS。1-4組為:MG-LG-G-;MG-LG-G+;MG-LG+G-;MG-LG+G+。5-8組為:MG+LG-G-;MG+LG-G+;MG+LG+G-;MG+LG+G+。MG-指對(duì)照組巨噬細(xì)胞;MG+指模型組巨噬細(xì)胞;LG-指對(duì)照組淋巴細(xì)胞;LG+指模型組淋巴細(xì)胞;G-指體外PBS;G+指體外1-3-β-葡聚糖。每組加入伴刀豆蛋白刺激生長(zhǎng)。放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí)。
　　 四

9、、提取RNA及檢測(cè)Foxp3表達(dá)水平
　　 于共培養(yǎng)細(xì)胞中分離出淋巴細(xì)胞,加1mlTrizol試劑,離心靜置,加氯仿離心,轉(zhuǎn)移新管加異丙醇,并加入4℃預(yù)冷的75%7,醇,離心加RNase-free水溶解總RNA,測(cè)濃度并調(diào)整至1μg/μl。參照TaKaRa公司的逆轉(zhuǎn)錄酶操作說明書,將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,之后配制PCR反應(yīng)液于ABI7500儀器進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。相對(duì)定量法計(jì)算各組淋巴細(xì)胞目標(biāo)基因FoXp3mRNA相對(duì)表達(dá)量。

10、r>　　 五、ELISA檢測(cè)Th1型、Th2型及抑制性細(xì)胞因子的分泌
　　 在ELISA試劑板中每孔加入100μl包被抗體,冰箱4℃過夜。次日,棄液洗滌。每孔加200μl檢測(cè)緩沖液室溫孵育1小時(shí)。加一定稀釋的待檢樣品及標(biāo)準(zhǔn)品100μl于上已述包被反應(yīng)孔,置37℃孵育2小時(shí)。洗滌。(同時(shí)做空白孔,陰性對(duì)照孔及陽性對(duì)照孔)。于各反應(yīng)孔加100μl檢測(cè)抗體室溫孵育1小時(shí),洗滌。室溫加100μl檢測(cè)酶孵育30分鐘。100μl底物顯色1

11、5分鐘左右。于各反應(yīng)孔中加50μl反應(yīng)終止液。可于白色背景上,直接用肉眼觀察結(jié)果:反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深,陽性程度越強(qiáng),陰性反應(yīng)為無色或極淺。于450nm處,ELISA酶標(biāo)儀以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值。
　　 六、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析
　　 此實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)五次(n=5)。全部數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析,統(tǒng)計(jì)結(jié)果表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤。采用單因素方差分析比較各組間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,當(dāng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí),用LSD或SNK法進(jìn)行兩

12、兩比較,P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 一、1-3-β-葡聚糖誘導(dǎo)體外培養(yǎng)淋巴細(xì)胞Foxp3mRNA表達(dá)
　　 培養(yǎng)48h,1-3-β-葡聚糖體外刺激誘導(dǎo)體外共培養(yǎng)細(xì)胞中的淋巴細(xì)胞Foxp3mRNA表達(dá)。Foxp3是調(diào)節(jié)性淋巴細(xì)胞的特征性標(biāo)志,在巨噬細(xì)胞與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)條件下,1-3-β-葡聚糖體外刺激可能誘導(dǎo)Foxp3mRNA表達(dá)。
　　 二、1-3-β-葡聚糖抑制體外共培養(yǎng)細(xì)胞T

13、h1型細(xì)胞因子的分泌
　　 體外1-3-β-葡聚糖刺激抑制共培養(yǎng)細(xì)胞分泌IL-2。培養(yǎng)24h,體內(nèi)刺激的淋巴細(xì)胞分泌較多的IL-2。但培養(yǎng)48h,體外1-3-β-葡聚糖刺激對(duì)IL-2分泌的抑制作用比淋巴細(xì)胞活化作用更為明顯。綜合觀察巨噬細(xì)胞未刺激組和巨噬細(xì)胞刺激組IL-2細(xì)胞因子濃度,趨勢(shì)一致,表明巨噬細(xì)胞是否活化對(duì)IL-2分泌無明顯影響。
　　 體外1-3-β-葡聚糖刺激對(duì)IFN-γ的分泌影響不明顯。淋巴細(xì)胞刺激作用較

14、明顯。培養(yǎng)24h,體內(nèi)刺激的淋巴細(xì)胞分泌較多的IFN-γ。且培養(yǎng)48h,體外培養(yǎng)刺激巨噬細(xì)胞及刺激淋巴細(xì)胞分泌濃度更高的IFN-γ。綜合觀察巨噬細(xì)胞未刺激組和巨噬細(xì)胞刺激組IFN-γ細(xì)胞因子濃度,趨勢(shì)并不完全一致,表明與IL-2不同,巨噬細(xì)胞刺激可能影響IFN-γ分泌。
　　 三、1-3-β-葡聚糖促進(jìn)體外共培養(yǎng)細(xì)胞Th2型細(xì)胞因子的分泌
　　 體外1-3-β-葡聚糖刺激促進(jìn)共培養(yǎng)細(xì)胞分泌IL-4。培養(yǎng)24h,體內(nèi)刺激的

15、淋巴細(xì)胞分泌較多的IL-4。培養(yǎng)48h后,體內(nèi)刺激的淋巴細(xì)胞也顯示了促進(jìn)IL-4分泌作用。綜合觀察巨噬細(xì)胞未刺激組和巨噬細(xì)胞刺激組IL-4細(xì)胞因子濃度,趨勢(shì)基本一致,表明巨噬細(xì)胞是否刺激對(duì)IL-4分泌作用不明顯。
　　 四、1-3-β-葡聚糖促進(jìn)體外共培養(yǎng)細(xì)胞抑制性細(xì)胞因子的分泌
　　 體外1-3-β-葡聚糖刺激誘導(dǎo)共培養(yǎng)細(xì)胞分泌IL-10。淋巴細(xì)胞體內(nèi)刺激也促進(jìn)了IL-10分泌。綜合觀察巨噬細(xì)胞未刺激組和巨噬細(xì)胞刺激組

16、IL-10細(xì)胞因子濃度,趨勢(shì)一致,表明巨噬細(xì)胞是否刺激對(duì)IL-10分泌無明顯作用。
　　 體外1-3-β-葡聚糖刺激誘導(dǎo)共培養(yǎng)細(xì)胞分泌TGF-β。淋巴細(xì)胞的體內(nèi)刺激對(duì)TGF-β的分泌有一定促進(jìn)作用。綜合觀察巨噬細(xì)胞未刺激組和巨噬細(xì)胞刺激組TGF-β細(xì)胞因子濃度,趨勢(shì)一致,表明巨噬細(xì)胞是否刺激對(duì)TGF-β分泌無影響。
　　 結(jié)論:
　　 1、1-3-β-葡聚糖抑制體外共培養(yǎng)細(xì)胞Th1型細(xì)胞因子的分泌。