不同模式死亡細(xì)胞對巨噬細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、細(xì)胞死亡是多細(xì)胞生物的重要生命過程之一，在生物體的發(fā)育、防御及自穩(wěn)過程中起重要作用。死亡細(xì)胞表面表達(dá)的特異性標(biāo)志物如磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS），使得它們能快速被吞噬細(xì)胞所吞噬，并引起相應(yīng)的免疫學(xué)事件。吞噬細(xì)胞識別的死亡細(xì)胞可分為兩種：凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。凋亡（apoptosis）是一種程序化的、需要消耗能量的、不引起組織炎癥反應(yīng)和損傷的細(xì)胞死亡過程，壞死是（necrosis）一種非程序化的、不需要消耗能量

2、的、引起組織炎癥反應(yīng)和損傷的細(xì)胞死亡過程。近10年的研究證明，兩種不同死亡方式的細(xì)胞在自身免疫、腫瘤免疫、感染免疫以及移植免疫等過程中均發(fā)揮重要的作用。 對于死亡細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的機(jī)制，作者的導(dǎo)師首次提出了“細(xì)胞死亡方式”免疫識別理論模型，認(rèn)為凋亡細(xì)胞誘導(dǎo)免疫耐受而壞死細(xì)胞誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。我們既往的研究表明：凋亡細(xì)胞能夠抑制T細(xì)胞活化、延長移植物存活并誘導(dǎo)免疫耐受。文獻(xiàn)報導(dǎo)壞死細(xì)胞能夠活化免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)抗感染能力。但是對于不同方式

3、死亡細(xì)胞如何調(diào)控免疫反應(yīng)，尤其是其對吞噬細(xì)胞功能的影響仍不清楚。 在革蘭氏陰性細(xì)菌感染時會釋放大量脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）進(jìn)入血液循環(huán)。已知LPS可以激活巨噬細(xì)胞釋放腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素1（interlukin-1，IL-1）、白細(xì)胞介素6（interlukine-6，IL-6）、白細(xì)胞介素8（interlukine-8，IL-8）

4、等多種炎癥介質(zhì)，誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合癥。由于炎癥部位往往同時存在廣泛的細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡，那么在細(xì)菌感染、細(xì)菌代謝產(chǎn)物存在的情況下，壞死細(xì)胞或凋亡細(xì)胞是否會調(diào)控細(xì)菌感染所引起的免疫反應(yīng)呢？為此，我們擬首先通過體外研究，以炎性細(xì)胞因子（TNF-α和IL-6）分泌為指標(biāo)，探討不同方式死亡細(xì)胞本身以及在LPS刺激下對吞噬細(xì)胞功能的影響。 目的： 研究和比較不同模式死亡細(xì)胞被吞噬后對巨噬細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用，并闡明其可

5、能的分子機(jī)制，為“細(xì)胞死亡方式免疫識別模型”這一假說提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1.小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7的培養(yǎng) 小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7，由南方醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室姜勇教授饋贈，用含5%胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)。 2.EL-4細(xì)胞的培養(yǎng) 小鼠T淋巴細(xì)胞株EL-4，由南方醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室富寧教授

6、饋贈，用含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)。 3.小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 取6周左右的Balb/c小鼠，腹腔注射1ml無菌液體石蠟，3-4天后放血處死小鼠，無菌PBS反復(fù)灌洗腹腔，吸出滲液，用含5%胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌3次后，37℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)。 4.凋

7、亡和壞死細(xì)胞的制備 無菌操作取Balb/c小鼠胸腺并分離淋巴細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基RPMI-1640調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml。 誘導(dǎo)小鼠胸腺細(xì)胞凋亡條件：培養(yǎng)皿直徑6cm，含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基4ml，地塞米松（Dexamethasone，Dex）濃度5×106M，孵育時間6h。 誘導(dǎo)EL-4細(xì)胞凋亡條件：培養(yǎng)皿直徑6cm，含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基4ml，波長310nm的紫

8、外線（ultraviolet ray，UV）燈管下10cm處照射60min，孵育時間16h。 誘導(dǎo)小鼠胸腺細(xì)胞及EL-4細(xì)胞壞死條件：無血清RPMI-1640培養(yǎng)基4ml，56℃水浴加熱60min。 收集處理后的細(xì)胞檢測凋亡/壞死率，按Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒的操作說明書進(jìn)行。 5.建立巨噬細(xì)胞和死亡細(xì)胞的共培養(yǎng)模型 在96孔板上種植RAW264.7細(xì)胞或小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞，分為3組，

9、即對照組、凋亡細(xì)胞處理組（凋亡組）和壞死細(xì)胞處理組（壞死組）。對于凋亡組和壞死組，將巨噬細(xì)胞分別與1：5比率的凋亡/壞死細(xì)胞共培養(yǎng)。而對照組以等體積完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。37℃、5%CO2孵箱孵育18h后收集上清，-20℃保存。 6.建立巨噬細(xì)胞與死亡細(xì)胞和LPS作用下的共培養(yǎng)模型 在96孔板上種植RAW264.7細(xì)胞或小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞，分為3組，即對照組、凋亡組和壞死組，凋亡組和壞死組巨噬細(xì)胞分別與1：5比率的凋亡/壞死

10、細(xì)胞共培養(yǎng)，對照組加入等體積完全培養(yǎng)基作為空白對照處理。共培養(yǎng)1h后，加入LPS，并調(diào)節(jié)終濃度為100ng/ml，37℃、5%CO2孵箱孵育18h后收集上清，-20℃保存。 7.多細(xì)胞因子的檢測 以Bio-Plex懸浮芯片系統(tǒng)和小鼠細(xì)胞因子檢測試劑盒檢測不同處理組的細(xì)胞共培養(yǎng)物上清中細(xì)胞因子。 8.統(tǒng)計學(xué)分析 采用GraphPad Prism5.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用t檢驗(yàn)，比較實(shí)驗(yàn)組與對

11、照組之間的差異。 結(jié)果： 1.4-6周小鼠胸腺可分離出細(xì)胞1-2×108。由于在前期研究中發(fā)現(xiàn)，對于小鼠胸腺淋巴細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)，Dex誘導(dǎo)法明顯優(yōu)于UV，因此我們對Dex誘導(dǎo)方法進(jìn)行了深入探討。發(fā)現(xiàn)影響細(xì)胞凋亡的主要因素有：Dex濃度，細(xì)胞濃度，孵育時間。對Dex誘導(dǎo)法反復(fù)研究，發(fā)現(xiàn)制備早期凋亡細(xì)胞的最佳條件為：細(xì)胞濃度5×106/ml，Dex濃度5×10-6M，孵育時間6h。此條件誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞計數(shù)法得出

12、早期凋亡率（44.512±3.565）%，晚期凋亡率/壞死率晚期凋亡細(xì)胞數(shù)為（8.753±3.276）%。 制備EL-4凋亡細(xì)胞的最佳條件為：310nm UV，照射距離10cm，照射時間60min，孵育時間16h。此條件誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞計數(shù)法得出早期凋亡率（27.975±0.728）%，晚期凋亡率/壞死率（46.727±5.987）%。 細(xì)胞壞死的誘導(dǎo)方法均為：56℃加熱60min。應(yīng)用流式細(xì)胞計數(shù)法得出壞死

13、率（95.247±3.977）%（小鼠胸腺淋巴細(xì)胞）和（86.053±3.616）%（EL-4細(xì)胞）。 2.凋亡細(xì)胞能夠抑制LPS作用下的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子的能力。和對照組相比，凋亡細(xì)胞下調(diào)巨噬細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子的能力（P<0.05）。而且，凋亡細(xì)胞處理過的巨噬細(xì)胞再予以LPS刺激，培養(yǎng)物上清中炎癥性細(xì)胞因子TNF-α和IL-6分泌表達(dá)減少（P<0.05）。 3.壞死細(xì)胞能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥性因子。與對照組相

14、比較，與壞死細(xì)胞共培養(yǎng)后的巨噬細(xì)胞，產(chǎn)生炎癥性細(xì)胞因子的能力明顯增強(qiáng)（P<0.05）。而且，壞死細(xì)胞處理后的巨噬細(xì)胞再用LPS刺激，巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥性細(xì)胞因子如TNF-α和IL-6的量進(jìn)一步增加，達(dá)到LPS單獨(dú)作用時的兩倍（P<0.05）。 結(jié)論： 1.Dex誘導(dǎo)小鼠胸腺細(xì)胞凋亡的最佳條件：在直徑6cm的培養(yǎng)皿中加含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液4ml，Dex濃度5×10-6M，細(xì)胞濃度5×106/ml，孵育時

15、間6h。UV誘導(dǎo)EL-4細(xì)胞凋亡的最佳條件：在直徑6cm的培養(yǎng)皿中加含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液4ml，310nm UV，照射距離10cm，照射時間60min，孵育時間16h。加熱法誘導(dǎo)兩種細(xì)胞壞死的最佳條件：56℃加熱60min。 2.在巨噬細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系中，用凋亡細(xì)胞、LPS或兩者聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)行處理，檢測各組炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生情況。結(jié)果顯示，凋亡細(xì)胞能夠抑制巨噬細(xì)胞在LPS刺激下所產(chǎn)生炎癥性的細(xì)胞因子TNF-α

16、和IL-6。因此，凋亡細(xì)胞抑制免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)免疫耐受可能與其巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子有關(guān)。 3.在巨噬細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系中，分別用壞死細(xì)胞、LPS或兩者聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)行處理，檢測各組炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生情況。結(jié)果顯示，與未經(jīng)任何處理的對照組相比，壞死細(xì)胞和LPS均顯著提高了巨噬細(xì)胞分泌TNF-α和IL-6的量。若壞死細(xì)胞與LPS聯(lián)合應(yīng)用，則兩種炎性細(xì)胞因子的分泌進(jìn)一步增加。這一發(fā)現(xiàn)提示，細(xì)菌感染時所伴有的細(xì)胞壞死，會導(dǎo)致強(qiáng)烈而持久的炎性反應(yīng)