卡介苗對巨噬細胞炎癥相關細胞因子調(diào)控的研究.pdf

1、目的:
　　盡管經(jīng)過了一百年的研究，但是結(jié)核桿菌感染依然是全世界范圍內(nèi)健康的主要問題，并且是導致人們死亡的主要原因。每年有一千萬新的病例被診斷出來，有200萬人死于結(jié)核。結(jié)核的發(fā)病率增高和艾滋病人的增加相關連的，而且出現(xiàn)了很多耐藥的結(jié)核桿菌。通常來說，宿主的免疫系統(tǒng)可以抑制結(jié)核桿菌的生長，可以導致潛在的感染，是以在肉芽腫中存活的但不活躍的細菌為特點，世界三分之一的人口有結(jié)核的潛在感染，只有百分之十的人發(fā)展為活動性肺結(jié)核。結(jié)核桿菌上

2、的抗原和巨噬細胞和樹突狀細胞表面的模式識別受體的結(jié)合可以導致這些細胞的活化和分泌細胞因子，這些細胞因子可以調(diào)節(jié)先天免疫應答，并且可以啟動獲得性免疫。結(jié)核菌感染后產(chǎn)生的細胞因子不總是對機體起保護作用，有一些對結(jié)核是有益的。
　　IL-12家族中的IL-23是由兩個亞基(p40和p19)組成的異源二聚體結(jié)構(gòu)，激活的抗原提呈細胞可以產(chǎn)生IL-23，它對于維持體內(nèi)的Th17陽性細胞有重要作用，Th17細胞和腫瘤以及炎癥相關的疾病有其相關性

3、。本研究首先觀察BCG（卡介苗）接種后對相關T細胞亞群的影響，接著探討抗原提呈細胞在BCG刺激下所產(chǎn)生的促炎和抑炎因子，重點研究了BCG對IL-23的調(diào)控機制。通過上述研究可為臨床應用奠定分子學基礎。
　　方法:
　　1.小鼠BMDM（骨髓來源的巨噬細胞）的制備和培養(yǎng)。
　　2.BCG接種C57BL/6小鼠，收集淋巴結(jié)細胞檢測和感染相關的T細胞亞群。
　　3.用ELISA方法檢測BCG刺激后BMDM細胞培養(yǎng)上清液

4、中IL-12、IL-6、IL-10、IL-23和IL-1beta的量。
　　4.用ELISA方法檢測BCG刺激后RAW264.7細胞培養(yǎng)上清液中IL-23的水平。實時定量PCR檢測IL-23p19mRNA的表達情況。
　　5.針對IL-23p19DNA設計隨機引物，對BCG刺激后RAW264.7細胞做實時定量PCR檢測IL-23p19轉(zhuǎn)錄前的變化情況。
　　6.對RAW264.7細胞用BCG刺激后加入轉(zhuǎn)錄抑制劑5-甲基

5、苯并瞇唑(dichlorobenzimidazole)+放線菌素D(ACD)，阻止新的RNA產(chǎn)生，檢測兩組各時間點p19mRNA衰變情況。
　　7.用免疫印跡法檢測被刺激RAW264.7細胞中總p65和磷酸化p65的含量。
　　8.用不同濃度的NF-κB信號轉(zhuǎn)導通路阻斷劑SN50作用RAW264.7細胞后用BCG刺激，實時定量PCR檢測各組p19mRNA水平。
　　9.設計質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞使其高表達p65，

6、再BCG刺激細胞，通過實時定量PCR檢測各組p19mRNA水平。
　　結(jié)果:
　　1.C57BL/6小鼠分組給予BCG，用流式細胞技術檢測淋巴結(jié)中細胞組成。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BCG導致產(chǎn)生IFN-γ的CD4+T細胞、IL-17的CD4+T細胞數(shù)量、IFN-γ的CD8+T細胞數(shù)量均有增加。
　　2.體外實驗顯示BCG明顯增加小鼠BMDM對IL-12，IL-23，IL-1 beta，IL-6和IL-10的分泌。
　　3.小鼠

7、巨噬細胞系RAW264.7使用BCG刺激后明顯促進IL-23的分泌，使IL-23p19mBNA表達明顯增加。
　　4.設計含有IL-23p19基因內(nèi)含子和外顯子的引物，通過實時定量PCR檢測初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物含量，發(fā)現(xiàn)BCG可以在轉(zhuǎn)錄水平上促進了IL-23p19表達和降低了IL-23p19mRNA的衰變速度。
　　5.BCG刺激RAW264.7細胞，用免疫印跡法檢測出明顯提高磷酸化p65的含量，說明NF-κB通路在結(jié)核感染中發(fā)揮重

8、要作用。
　　6.不同含量NF-κB通路阻斷劑SN50作用后再用BCG刺激顯示p19mRNA的表達明顯下降。用對照質(zhì)粒和NF-κB p65質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞后使用BCG刺激，實時定量PCR顯示高表達NF-κB p65的RAW264.7細胞在受BCG刺激后p19mRNA水平明顯升高。
　　結(jié)論:
　　1.BCG可以在小鼠中導致產(chǎn)生IFN-γ的CD4+T的升高，同時可以提高產(chǎn)生IFN-γ的CD8+T細胞和Th