MiR-758靶向沉默ABCA1調(diào)控巨噬細(xì)胞炎癥因子的表達(dá).pdf

1、目的：本研究擬探討miR-758對ABCA1的表達(dá)及其介導(dǎo)的關(guān)鍵信號通路JAK2/STAT3/TTP的影響，從而探明miR-758影響TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥因子表達(dá)的作用及機(jī)制。
　　方法：運(yùn)用生物信息學(xué)（miRBase）的方法鑒定了鼠源性miR-758，探討了鼠源性miR-758的最新表示方法，并重點(diǎn)采用TargetScanS數(shù)據(jù)庫對小鼠miR-758與ABCA1結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了分析；熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)檢測了mi

2、R-758與ABCA1的結(jié)合情況，并用突變技術(shù)對結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了突變，重新檢測了miR-758與ABCA1的結(jié)合情況；在小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-758激動劑mimics或抑制劑inhibitor，采用qPCR和Western bloting檢測了ABCA1 mRNA和蛋白的表達(dá)情況；采用 ELISA檢測了細(xì)胞分泌的 TNF-α、IL-1β和 IL-6等炎癥因子；采用miR-758激動劑mimics或抑制劑inhibit

3、or轉(zhuǎn)染處理小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞，然后再用JAK2/STAT3信號通路抑制劑AG-490或TTP抑制物siRNA處理細(xì)胞，重新采用ELISA檢測了細(xì)胞分泌的TNF-α、IL-1β和 IL-6等炎癥因子，探討了miR-758調(diào)控細(xì)胞分泌的TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥因子的機(jī)制。
　　結(jié)果：根據(jù)最新的 miRBase數(shù)據(jù)庫顯示，鼠源性 miR-758的最新表示方法為 miR-758-3p，與最原始的 miR-758序

4、列完全一致。TargetScanS數(shù)據(jù)庫顯示miR-758與ABCA1的結(jié)合具有兩個位點(diǎn)，一個定位于530-537區(qū)域（位點(diǎn)1），一個定位于3119-3126區(qū)域（位點(diǎn)2）。熒光素報(bào)告基因與基因突變試驗(yàn)表明miR-758激動劑能顯著抑制ABCA1 WT（野生型）熒光素酶活性，突變1位點(diǎn)后其抑制作用依然顯著，突變2位點(diǎn)和聯(lián)合突變1/2位點(diǎn)后miR-758的抑制作用顯著消失。qPCR和 WB技術(shù)顯示，miR-758激動劑能夠顯著抑制ABCA

5、1的 mRNA和蛋白表達(dá)，而 miR-758抑制劑則能夠顯著促進(jìn)ABCA1的mRNA和蛋白的表達(dá)，提示miR-758能夠直接調(diào)控內(nèi)源性ABCA1表達(dá)。ELISA結(jié)果顯示miR-758激動劑能夠顯著抑制TNF-α, IL-1β, IL-6等炎癥因子分泌，而miR-758抑制劑則顯著促進(jìn)TNF-α、IL-1β和 IL-6等炎癥因子分泌。研究顯示 ABCA1主要通過激活JAK2/STAT3/TTP信號通路發(fā)揮抗炎效應(yīng)，因此我們猜測miR-75

6、8通過ABCA1調(diào)控JAK2/STAT3/TTP信號通路，進(jìn)而影響TNF-α、IL-1β和 IL-6等炎癥因子的表達(dá)，結(jié)果顯示 JAK2/STAT3信號通路抑制劑AG-490和TTP抑制物siRNA顯著增強(qiáng)了TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥因子分泌，而JAK2/STAT3信號通路抑制劑AG-490和TTP抑制物siRNA能夠顯著削弱miR-758抑制劑對TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥因子的抑制作用，并與miR-758激動劑