miR-19b靶向調(diào)控巨噬細(xì)胞ABCA1對apoE---鼠動脈粥樣硬化的影響.pdf

1、動脈粥樣硬化性疾病在全球罹患率與致死率均名列前茅，嚴(yán)重危害人類健康。其早期病變的標(biāo)志性特征為血管內(nèi)皮下大量巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積和泡沫細(xì)胞的形成。泡沫細(xì)胞最終壞死崩解釋放出胞內(nèi)的膽固醇，構(gòu)成動脈粥樣硬化斑塊的主要成分，進(jìn)一步促進(jìn)動脈粥樣硬化的進(jìn)展。因此，促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出及體內(nèi)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(reverse cholesterol transport，RCT)，從而抑制泡沫細(xì)胞形成和血管壁內(nèi)脂質(zhì)沉積對動脈粥樣硬化性疾病的防治具有重要意

2、義。
　　三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1(ATP binding cassette transporter A1，ABCA1)為膜整合蛋白，以ATP為能源將胞內(nèi)游離膽固醇和磷脂轉(zhuǎn)運到胞膜，最終與附在細(xì)胞表面的載脂蛋白AI(apoprotein AI，apoAI)結(jié)合。這一過程為高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）生成所必需，也是促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)過量膽固醇流出及RCT的關(guān)鍵步驟。ABCA1在巨噬細(xì)胞中的

3、表達(dá)和活性受到轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平的嚴(yán)密調(diào)控。
　　microRNA是一類內(nèi)生性的、長約22個堿基的小分子RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)。microRNA通過堿基互補配對與靶基因的3’非翻譯區(qū)（3’ untranslated region，3’UTR）結(jié)合，從而導(dǎo)致靶基因mRNA降解和翻譯抑制。文獻(xiàn)報道m(xù)iR-19b與胞內(nèi)脂質(zhì)代謝密切相關(guān)。高脂飲食可誘導(dǎo)miR-19b表達(dá)上調(diào)，在人主動脈粥樣硬化斑塊及腹主動脈瘤中檢測到miR-19b

4、高表達(dá)，提示miR-19b在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但miR-19b致動脈粥樣硬化的相關(guān)作用機制尚不清楚。
　　為了探討miR-19b致動脈粥樣硬化的相關(guān)作用機制，前期采用生物信息學(xué)預(yù)測miR-19b的靶基因，發(fā)現(xiàn)miR-19b恰好具有靶向調(diào)控ABCA1的生物學(xué)理論基礎(chǔ)。據(jù)此設(shè)想，miR-19b靶向作用巨噬細(xì)胞ABCA1的表達(dá)，抑制胞內(nèi)膽固醇流出和RCT，促進(jìn)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積和血管壁脂質(zhì)沉積，從而導(dǎo)致動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展

5、。為了驗證miR-19b致動脈粥樣硬化機制的這一假說，我們首先在第一部分實驗中對miR-19b靶向作用ABCA1進(jìn)行了深入的生物信息學(xué)分析，并用熒光素酶報告基因驗證了miR-19b結(jié)合ABCA13’UTR，然后，在第二部分實驗中我們研究了miR-19b對巨噬細(xì)胞ABCA1表達(dá)、胞內(nèi)膽固醇流出及脂質(zhì)含量的影響，接著，在第三部分實驗中，我們觀察了miR-19b對apoE-/-小鼠的RCT、血脂水平及動脈粥樣硬化病變的影響，最后，在第四部分實

6、驗中，我們觀察了具有明顯調(diào)脂作用的薯蕷皂苷元（Diosgenin，Dgn）對巨噬細(xì)胞miR-19b水平、ABCA1表達(dá)、脂質(zhì)代謝及apoE-/-小鼠動脈粥樣硬化病變的影響，探討了Dgn通過抑制miR-19b抗動脈粥樣硬化的作用機制。本研究揭示了miR-19b在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的作用及其機制，為動脈粥樣硬化性疾病的防治提供新的干預(yù)靶點。
　　第一部分,miR-19b靶基因的預(yù)測及其與巨噬細(xì)胞ABCA13’UTR的靶向作用

7、　　目的：預(yù)測miR-19b與靶基因ABCA1的靶向結(jié)合及結(jié)合位點和自由能情況，在細(xì)胞水平驗證miR-19b是否與ABCA13’UTR靶向結(jié)合。
　　方法：從miRNAbase數(shù)據(jù)庫獲取成熟的miR-19b序列，從GeneBank查詢ABCA13’UTR序列。利用 miRDB、miRanda、miRNA Viewer、TargetScan和RNAhybrid在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測分析人/鼠miR-19b與ABCA1的結(jié)合情況、結(jié)合位點及結(jié)

8、合自由能情況。根據(jù)預(yù)測結(jié)果，用PCR方法擴增人THP-1巨噬細(xì)胞ABCA13’UTR，構(gòu)建野生型 psiCHECK?-2-ABCA1-WT3’UTR、突變型 psiCHECK?-2-ABCA1-Mut3’UTR和miR-19b mimic共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞，檢測熒光素酶報告基因的活性和ABCA13’UTR序列的mRNA水平變化。
　　結(jié)果：在成功獲取miR-19b成熟序列和ABCA13’UTR序列基礎(chǔ)上，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)人/鼠

9、ABCA13’UTR中存在多個結(jié)合位點，miR-19b與ABCA1的結(jié)合評分較高，且二者結(jié)合的自由能較低。miR-19b mimic與野生型psiCHECK?-2-ABCA1-WT3’UTR共轉(zhuǎn)染后抑制熒光素酶活性和ABCA13’UTR序列的mRNA水平，與突變型psiCHECK?-2-ABCA1-Mut3’UTR共轉(zhuǎn)染后熒光素酶活性和ABCA13’UTR序列的mRNA水平無變化。
　　結(jié)論：miR-19b具有靶向作用人/鼠ABC

10、A1的生物信息學(xué)基礎(chǔ)，能夠結(jié)合人巨噬細(xì)胞ABCA13’UTR。
　　第二部分,miR-19b靶向沉默人/鼠巨噬細(xì)胞ABCA1表達(dá)對膽固醇流出的影響
　　目的：觀察對miR-19b對人/鼠巨噬細(xì)胞ABCA1蛋白及mRNA表達(dá)水平、胞內(nèi)膽固醇流出和脂質(zhì)含量的影響。
　　方法：培養(yǎng)人 THP-1巨噬細(xì)胞和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞（mouse peritoneal macrophage，MPM），利用RiboFECTTMCP轉(zhuǎn)染試劑，

11、將miR-19b mimic或miR-19b inhibitor轉(zhuǎn)染到THP-1巨噬細(xì)胞/MPM中，實時熒光定量PCR和western blot檢測ABCA1 mRNA和蛋白表達(dá)；液體閃爍計數(shù)測定荷脂THP-1巨噬細(xì)胞/MPM細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出情況，HPLC檢測胞內(nèi)脂質(zhì)含量；油紅O染色顯示胞內(nèi)脂滴情況。
　　結(jié)果：轉(zhuǎn)染miR-19b mimic的THP-1巨噬細(xì)胞/MPM中ABCA1 mRNA和蛋白水平明顯下調(diào)，胞內(nèi)膽固醇流出減少，

12、胞內(nèi)總膽固醇（total cholesterol，TC）、膽固醇酯（cholesterol ester，CE）及游離膽固醇（free cholesterol，F(xiàn)C）的含量明顯增加，胞內(nèi)脂滴稠密且體積肥大，而轉(zhuǎn)染miR-19b inhibitor則剛好出現(xiàn)相反的結(jié)果。
　　結(jié)論：（1）miR-19b具有靶向抑制THP-1巨噬細(xì)胞/MPM中ABCA1 mRNA和蛋白表達(dá)的作用。（2）miR-19b具有調(diào)控THP-1巨噬細(xì)胞/MPM膽固

13、醇流出的功能，其機制可能與靶向調(diào)控ABCA1有關(guān)。
　　第三部分,miR-19b對apoE-/-小鼠膽固醇逆向轉(zhuǎn)運、動脈壁脂質(zhì)沉積和粥樣硬化病變的影響
　　目的：探討miR-19b對apoE-/-小鼠體內(nèi)RCT、血脂水平、主動脈壁脂質(zhì)沉積和粥樣硬化病變的影響及機制。
　　方法：高脂飲食（含15％豬油+0.25%膽固醇）喂養(yǎng)的45只apoE-/-小鼠，隨機分為3組：高脂對照組、miR-19b agomir組、miR-19

14、b antagomir組。液體閃爍計數(shù)測定MPM來源的RCT效率；酶氧化法檢測甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-c）和低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-c）等血脂水平；蘇丹Ⅳ染色顯示主動脈內(nèi)膜的動脈粥樣硬化病變情況；HE染色顯示主動脈竇動脈粥樣硬化病變

15、情況；油紅O染色觀察主動脈竇處脂質(zhì)沉積情況；Masson三色染色顯示斑塊中的膠原纖維；western blot檢測小鼠主動脈ABCA1蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：轉(zhuǎn)染miR-19b agomir明顯抑制apoE-/-小鼠糞便中3H固醇的放射活性，降低血漿HDL-c水平，升高LDL-c水平，增加主動脈內(nèi)膜的動脈粥樣硬化病變面積，加劇主動脈竇處脂質(zhì)沉積，降低斑塊的穩(wěn)定性，下調(diào)主動脈 ABCA1蛋白表達(dá)。轉(zhuǎn)染miR-19b antagomir

16、則明顯增加糞便中的固醇水平，改善血脂水平，抑制主動脈壁內(nèi)脂質(zhì)沉積和動脈粥樣硬化病變的進(jìn)展，上調(diào)ABCA1蛋白表達(dá)。
　　結(jié)論：（1）miR-19b損害apoE-/-小鼠體內(nèi)RCT，促進(jìn)血管壁內(nèi)的脂質(zhì)沉積和動脈粥樣硬化的進(jìn)展。（2）miR-19b的致動脈粥樣硬化效應(yīng)可能與靶向抑制apoE-/-小鼠主動脈ABCA1表達(dá)有關(guān)。
　　第四部分薯蕷皂苷元對miR-19b/ABCA1水平及apoE-/-小鼠主動脈病變的影響
　　目

17、的：觀察薯蕷皂苷元（Diosgenin，Dgn）對THP-1巨噬細(xì)胞/MPM中miR-19b與ABCA1水平及其對apoE-/-小鼠體內(nèi)RCT、血脂水平、主動脈壁粥樣硬化病變的影響，從而探討Dgn抗動脈粥樣硬化的作用機制。
　　方法：用Dgn處理并結(jié)合miR-19b mimic或inhibitor轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞/MPM后，實時熒光定量PCR檢測miR-19b水平，western blot檢測ABCA1蛋白表達(dá)；液體閃爍計數(shù)

18、測定荷脂THP-1巨噬細(xì)胞/MPM細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出情況， HPLC檢測胞內(nèi)脂質(zhì)含量。將高脂飲食（含15%豬油+0.25%膽固醇）喂養(yǎng)的60只apoE-/-小鼠隨機分為4組：高脂對照組、薯蕷皂苷元組、薯蕷皂苷元+miR-19b agomir組、薯蕷皂苷元+miR-19b antagomir組。液體閃爍計數(shù)測定MPM來源的RCT效率；酶氧化法檢測TG、TC、HDL-c和LDL-c等血脂水平；HE染色顯示主動脈竇動脈粥樣硬化病變情況；油紅 O

19、染色觀察主動脈竇處脂質(zhì)沉積情況；Masson三色染色顯示斑塊中的膠原纖維。
　　結(jié)果：Dgn呈劑量和時間依賴性上調(diào)THP-1巨噬細(xì)胞/MPM中ABCA1蛋白表達(dá)，明顯降低 miR-19b水平，增加胞內(nèi)膽固醇流出，減少胞內(nèi) TC、CE及FC的含量。Dgn增加 apoE-/-小鼠糞便中3H固醇的放射活性，升高血漿HDL-c水平，降低LDL-c水平，上調(diào)主動脈ABCA1表達(dá)，減少主動脈內(nèi)膜的動脈粥樣硬化病變面積，減輕主動脈竇處脂質(zhì)沉積，