TET2對apoE---小鼠動脈粥樣硬化病變的影響及其作用機制研究.pdf

1、TET2蛋白(ten-eleven-translocation2)是一種DNA甲基化修飾酶，它是在進化上高度保守的TET(ten-eleven-translocation)家族成員之一，通過將5mC氧化為5hmC而發(fā)揮作用。研究在動脈斑塊發(fā)生初期， DNA甲基化譜異常，表明斑塊中自噬異常。本課題組前期研究表明,高脂飲食 apoE-/-小鼠動脈粥樣硬化病變中自噬障礙、TET2表達水平下調(diào)，推測 TET2可能通過調(diào)節(jié)自噬途徑從而發(fā)揮抗動脈粥

2、樣硬化作用。為證實該假說，本研究首先采用apoE-/-小鼠動物模型結(jié)合慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，觀察TET2過表達對apoE-/-小鼠動脈粥樣硬化病變以及自噬的影響；在此基礎(chǔ)上，通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法觀察TET2對HUVECs（Human umbilical vein endothelial cells）自噬及其潛在的分子機制。
　　目的:探索TET2對apoE-/-小鼠動脈粥樣硬化病變的影響及其可能潛在分子機制。
　　方法:8周齡的雄性

3、apoE-/-小鼠40只，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機分為兩組：對照組、過表達TET2組，每組20只，分別尾靜脈注射生理鹽水及過表達TET2慢病毒，每六周注射一次，每只小鼠慢病毒注射量為4×107TU/次，兩組小鼠均高脂飲食，自由飲水，喂養(yǎng)12周后，將小鼠處死。全自動生化分析儀測定兩組血脂水平，蘇丹Ⅳ染色法及體視顯微鏡下觀察主動脈脂質(zhì)蓄積情況，HE染色法觀察主動脈根部病理形態(tài)改變，油紅O染色法檢測主動脈竇部動脈粥樣硬化病變處脂質(zhì)蓄積的情況，免

4、疫熒光法檢測主動脈根部TET2和自噬標(biāo)志物Beclin1、微管相關(guān)蛋白輕鏈3Ⅱ（LC3Ⅱ）和自噬障礙標(biāo)記物p62表達情況，及主動脈根部甲基化水平改變情況。培養(yǎng) HUVECs，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染使細胞過表達或沉默TET2后，50μg/mL oxLDL處理細胞24小時，免疫熒光細胞化學(xué)方法觀察細胞TET2蛋白、5hmC、5mC含量變化情況；Western blotting檢測細胞中TET2蛋白、自噬標(biāo)記物Beclin1、LC3、P62蛋白的表達；以m

5、RFP-GFP-LC3腺病毒感染細胞36h，觀察其自噬流變化；亞硫酸氫鹽修飾后測序法檢測自噬相關(guān)基因Beclin1啟動子甲基化改變情況。
　　結(jié)果:過表達 TET2組的血脂水平與對照組相比無明顯改變，但主動脈粥樣硬化病變面積明顯減少； HE結(jié)果表明與對照組相比，過表達TET2組小鼠動脈粥樣硬化程度降低，油紅O染色分析結(jié)果顯示過表達TET2可以減少apoE-/-小鼠主動脈竇部動脈粥樣硬化斑塊脂質(zhì)蓄積；免疫熒光及Western blo

6、t結(jié)果表明動脈粥樣硬化斑塊中5hmC含量及自噬標(biāo)記物 Beclin1、LC3Ⅱ含量明顯增加，p62的表達水平降低。過表達TET2能夠使細胞TET2、Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達上調(diào)，5hmC含量增加，5mC含量減少，P62蛋白表達下調(diào)；而TET2低表達能夠使Beclin1、LC3Ⅱ蛋白的表達下調(diào)，P62蛋白表達上調(diào)；細胞轉(zhuǎn)染mRFP-GFP-LC3腺病毒后，過表達TET2組細胞出現(xiàn)明顯增強的自噬流；甲基化檢測結(jié)果表明，過表達TET2