TET2對(duì)CSE-H2S體系的調(diào)控及其在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生中的作用研究.pdf

1、大量資料表明，內(nèi)源性硫化氫（Hydrogen sulfide，H2S）是繼一氧化氮和一氧化碳之后的第三種氣體信號(hào)分子，廣泛參與了多種生理和病理過程。在心血管系統(tǒng)，H2S主要是由胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase，CSE)催化生成。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性CSE/H2S體系缺陷促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，As)發(fā)生發(fā)展，上調(diào)內(nèi)源性CSE/H2S體系則抑制As病變形成。血管內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)是As發(fā)生

2、的始動(dòng)環(huán)節(jié)，H2S對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞功能的保護(hù)是其拮抗As主要機(jī)制之一。目前，CSE/H2S體系已成為As干預(yù)的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，探討CSE/H2S體系的調(diào)控機(jī)制，尋找調(diào)控這一體系的潛在靶標(biāo)，對(duì)于保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，抑制As進(jìn)展具有重要意義。DNA去甲基化酶10-11位轉(zhuǎn)位蛋白2( Ten-Eleven-Translocation protein2，TET2)可以把5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5-mC)轉(zhuǎn)化為5-羥甲基化胞

3、嘧啶(5-hydroxymethylcytosine，5-hmC)，在DNA去甲基化中扮演重要角色。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)人As斑塊中TET2和5-hmC表達(dá)水平明顯低于正常血管，而且As斑塊中TET2的表達(dá)量與As的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，但TET2在As的發(fā)生發(fā)展中的具體作用及其機(jī)制目前尚不清楚。有文獻(xiàn)提示，在As的病理生理過程中TET2與CSE/H2S體系可能具有相關(guān)性，我們的生物信息學(xué)預(yù)分析結(jié)果提示CSE啟動(dòng)子具有發(fā)生DNA甲基化修飾的潛在可能性

4、。
　　因此，本研究提出如下科研假說：“TET2通過上調(diào)內(nèi)源性CSE/H2S體系而改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)拮抗As”。為證實(shí)這一科研假說，本研究將首先構(gòu)建TET2過表達(dá)和 TET2低表達(dá)的小鼠As模型，在整體水平觀察TET2對(duì)CSE/H2S體系調(diào)控作用及對(duì)As病變形成的影響；然后，在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步闡明TET2通過調(diào)控CSE/H2S體系改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)的作用及分子機(jī)制。本項(xiàng)目的完成，有望從DNA去甲基化這個(gè)新視點(diǎn)揭示內(nèi)

5、源性CSE/H2S體系的調(diào)控機(jī)制，并進(jìn)一步揭示TET2在As發(fā)病中的作用，為As的防治提供新的藥物作用靶點(diǎn)和干預(yù)途徑。
　　大量資料表明，內(nèi)源性硫化氫（Hydrogen sulfide，H2S）是繼一氧化氮和一氧化碳之后的第三種氣體信號(hào)分子，廣泛參與了多種生理和病理過程。在心血管系統(tǒng)，H2S主要是由胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase，CSE)催化生成。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性CSE/H2S體系缺陷促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬

6、化(Atherosclerosis，As)發(fā)生發(fā)展，上調(diào)內(nèi)源性CSE/H2S體系則抑制 As病變形成。血管內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)是As發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)，H2S對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞功能的保護(hù)是其拮抗As主要機(jī)制之一。目前，CSE/H2S體系已成為As干預(yù)的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，探討CSE/H2S體系的調(diào)控機(jī)制，尋找調(diào)控這一體系的潛在靶標(biāo)，對(duì)于保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，抑制As進(jìn)展具有重要意義。DNA去甲基化酶10-11位轉(zhuǎn)位蛋白2(Ten-Eleven-Transl

7、ocation protein2，TET2)可以把5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5-mC)轉(zhuǎn)化為5-羥甲基化胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine，5-hmC)，在DNA去甲基化中扮演重要角色。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)人As斑塊中TET2和5-hmC表達(dá)水平明顯低于正常血管，而且As斑塊中TET2的表達(dá)量與As的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，但TET2在As的發(fā)生發(fā)展中的具體作用及其機(jī)制目前尚不清楚。有文獻(xiàn)提示，在As的病理生

8、理過程中TET2與CSE/H2S體系可能具有相關(guān)性，我們的生物信息學(xué)預(yù)分析結(jié)果提示CSE啟動(dòng)子具有發(fā)生DNA甲基化修飾的潛在可能性。
　　因此，本研究提出如下科研假說：“TET2通過上調(diào)內(nèi)源性CSE/H2S體系而改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)拮抗As”。為證實(shí)這一科研假說，本研究將首先構(gòu)建TET2過表達(dá)和TET2低表達(dá)的小鼠As模型，在整體水平觀察TET2對(duì)CSE/H2S體系調(diào)控作用及對(duì)As病變形成的影響；然后，在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步闡

9、明TET2通過調(diào)控CSE/H2S體系改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)的作用及分子機(jī)制。本項(xiàng)目的完成，有望從DNA去甲基化這個(gè)新視點(diǎn)揭示內(nèi)源性CSE/H2S體系的調(diào)控機(jī)制，并進(jìn)一步揭示TET2在As發(fā)病中的作用，為As的防治提供新的藥物作用靶點(diǎn)和干預(yù)途徑。
　　目的：探索TET2過表達(dá)或低表達(dá)對(duì)ApoE-/-小鼠血管CSE/H2S體系以及As病變的影響。
　　方法：構(gòu)建TET2過表達(dá)慢病毒載體（LV-TET2）和TET2干擾慢病毒載體

10、（LV-TET2 shRNA），分別感染ApoE-/-小鼠，并高脂喂養(yǎng)，建立TET2過表達(dá)和TET2低表達(dá)的小鼠As模型。喂養(yǎng)12周時(shí)處死動(dòng)物，分別采用免疫組織熒光法、Western blotting、Dot blot檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈TET2、5-hmC表達(dá)情況；全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組小鼠血脂水平；改良的亞甲基藍(lán)法檢測(cè)血漿中H2S含量；蘇丹Ⅳ染色檢測(cè)主動(dòng)脈粥樣硬化病變面積；油紅O染色、Masson染色檢測(cè)主動(dòng)脈竇As斑塊脂質(zhì)蓄積的情況；

11、免疫組織熒光法檢測(cè)As斑塊巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)情況和內(nèi)皮完整性；免疫組織熒光法、熒光定量PCR或Western blotting分別檢測(cè)主動(dòng)脈CSE、ICAM-1、VCAM-1以及NF-κB p65的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：構(gòu)建的LV-TET2和LV-TET2 shRNA分別使ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈TET2、5-hmC過表達(dá)和低表達(dá)；對(duì)照組、LV-TET2組和LV-TET2 shRNA組三組小鼠血脂水平、體重?zé)o明顯差異；與對(duì)照組相比，LV

12、-TET2組小鼠血漿中H2S含量增加，主動(dòng)脈CSE mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)上調(diào)，同時(shí)該組小鼠As病變面積明顯減少、As斑塊中脂質(zhì)蓄積和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)減少，并且小鼠As斑塊表面內(nèi)皮較完整，主動(dòng)脈中ICAM-1、VCAM-1、NF-κB p65表達(dá)下調(diào)，而LV-TET2 shRNA組小鼠各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)的變化與LV-TET2組正好相反，且差異具有顯著性。
　　小結(jié)：①TET2過表達(dá)可上調(diào)ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈CSE/H2S體系，TET2低

13、表達(dá)則下調(diào)ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈CSE/H2S體系；②TET2過表達(dá)可降低ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈NF-κB p65以及ICAM-1、VCAM-1的表達(dá)，減少血管內(nèi)皮功能損傷，減輕小鼠As病變程度，TET2低表達(dá)則作用相反。
　　第二部分、TET2調(diào)控CSE/H2S體系抑制ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)的作用及機(jī)制研究
　　目的：以ox-LDL處理的HUVECs為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停^察細(xì)胞內(nèi)TET2表達(dá)情況以及CSE/H2S體

14、系的變化，并從去甲基化修飾的角度進(jìn)一步探討TET2通過調(diào)控CSE/H2S體系改善ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs功能失調(diào)的作用及分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.不同濃度ox-LDL處理HUVECs不同時(shí)間，實(shí)時(shí)定量PCR和Western blotting檢測(cè)細(xì)胞TET2、CSE mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，濾膜吸附亞甲基藍(lán)法、H2S特異性熒光探針法分別檢測(cè)細(xì)胞H2S生成率和H2S水平。
　　2.以TET2過表達(dá)質(zhì)粒、TET2干

15、擾質(zhì)粒、TET2過表達(dá)質(zhì)粒+CSEsiRNA和/或ox-LDL處理HUVECs細(xì)胞，濾膜吸附亞甲基藍(lán)法、H2S特異性熒光探針分別檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)H2S生成率和H2S水平，觀察HUVECs細(xì)胞與人單核細(xì)胞THP-1的黏附情況，實(shí)時(shí)定量PCR和/或Western blotting檢測(cè)細(xì)胞CSE、ICAM-1、VCAM-1、NF-κB p65表達(dá)以及IkBα的降解，并用免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞NF-κBp65核轉(zhuǎn)位的情況。
　　3.生物信息學(xué)分析

16、CSE基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島情況，以TET2過表達(dá)質(zhì)粒、TET2干擾質(zhì)粒和/或ox-LDL處理HUVECs細(xì)胞，BSP測(cè)序法定量檢測(cè)CSE基因啟動(dòng)子CpG島的甲基化狀態(tài)。
　　結(jié)果：
　　1.實(shí)時(shí)定量PCR和Western blotting結(jié)果顯示，ox-LDL呈濃度和時(shí)間依賴性下調(diào)HUVECs中TET2、CSE mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)，降低細(xì)胞H2S生成率和H2S水平。
　　2.TET2過表達(dá)可上調(diào)ox-LDL處理的H

17、UVECs細(xì)胞CSE mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)，增加細(xì)胞H2S生成率和H2S水平，TET2低表達(dá)的效應(yīng)與高表達(dá)的相反；與ox-LDL單獨(dú)處理組相比，TET2過表達(dá)組細(xì)胞與人單核細(xì)胞THP-1黏附的數(shù)目減少，細(xì)胞ICAM-1、VCAM-1 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)降低，并且IkBα降解和NF-κB核轉(zhuǎn)位均減少，TET2低表達(dá)組細(xì)胞情況則與TET2過表達(dá)組細(xì)胞相反，而加入CSEsiRNA抑制CSE/H2S體系后，TET2過表達(dá)改善HUVEC細(xì)胞功能

18、失調(diào)的作用被逆轉(zhuǎn)。
　　3.生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，CSE基因啟動(dòng)子區(qū)域具有CpG島，且各分析指標(biāo)明顯優(yōu)于CpG島的標(biāo)準(zhǔn)定義；BSP分析結(jié)果顯示，ox-LDL單獨(dú)處理組CSE 基因啟動(dòng)子CpG島甲基化頻率為56.8％，明顯高于對(duì)照組細(xì)胞的1.6%，而TET2過表達(dá)組和TET2干擾組細(xì)胞CSE基因啟動(dòng)子CpG島甲基
　　化頻率則分別為4%、77.6%，與ox-LDL單獨(dú)處理組相比差異均有顯著性。
　　小結(jié)：

19、r>　　1.ox-LDL處理的HUVECs中CSE/H2S體系下調(diào)，這與細(xì)胞中TET2表達(dá)變化趨勢(shì)一致；
　　2.TET2過表達(dá)可下調(diào)ox-LDL處理HUVEC細(xì)胞ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)，減少其與人單核細(xì)胞THP-1的黏附，改善HUVEC細(xì)胞功能失調(diào)；
　　3.TET2改善ox-LDL誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)的作用是通過上調(diào)CSE/H2S體系、抑制NF-κB活化這一途徑來實(shí)現(xiàn)的；
　　4.TET2可通過對(duì)CSE基