青葙總皂苷對ApoE---小鼠動脈粥樣硬化的治療作用及其促進自噬的作用機制研究.pdf

1、研究目的:研究青葙子(Celosiae Semen)中的三萜皂苷類化合物青葙總皂苷(TotalCeosins，TCS)抗動脈粥樣硬化的藥理作用及其機制，為TCS抗動脈粥樣硬化新藥的研制及青葙資源的開發(fā)利用提供依據(jù)。
　　研究方法:
　　動物實驗:通過給予ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠高脂飲食12周，建立動脈粥樣硬化模型，設(shè)置TCS3個給藥劑量:10mg/kg、30mg/kg、90mg/kg體重，給藥4周，觀察對動脈粥

2、樣硬化小鼠斑塊面積和穩(wěn)定性的影響。
　　體外實驗:通過ox-LDL刺激腹腔巨噬細胞24h，建立動脈粥樣硬化體外模型-泡沫細胞模型。在此基礎(chǔ)上，分別從TCS對腹腔巨噬細胞的吞噬、泡沫細胞的形成、相關(guān)基因mRNA的表達、細胞自噬相關(guān)蛋白的表達以及對自噬小體的形成和自噬流的影響來探討其藥理作用機制。
　　研究結(jié)果:
　　TCS抗動脈粥樣硬化的藥效學研究:TCS10mg/kg～90mg/kg劑量范圍內(nèi)，能夠顯著性減少ApoE-

3、/-小鼠主動脈中斑塊相對面積，減少主動脈內(nèi)壁增生，對動脈粥樣硬化有明顯治療作用。具體如下:1.主動脈整體油紅O染色結(jié)果顯示:模型組主動脈中有大量的斑塊存在，主動脈上游斑塊較大，向管腔中凸起明顯，至主動脈下游仍有較多斑塊存在。給與TCS后，主動脈內(nèi)斑塊不同程度的減少，可見斑塊區(qū)域減少，斑塊面積明顯減小，在主動脈的上游可見成型的小顆粒狀斑塊，在主動脈中下游斑塊急劇減少，幾乎不可見。2.主動脈根部橫切面油紅O染色病理切片顯示:模型組主動脈管腔

4、內(nèi)脂肪堆積明顯，三個主動脈瓣對應的動脈壁上均有斑塊，且斑塊較厚，占整個動脈管腔的橫切面積較大。給藥后，主動脈根部管腔脂肪沉積減少，管腔壁斑塊面積減小，TCS中劑量和高劑量組，部分主動脈壁較為光滑，未見明顯的脂肪堆積和斑塊存在。3.主動脈根部橫切面H&E染色病理切片顯示:模型組主動脈管腔內(nèi)，斑塊面積較大，在部分斑塊中出現(xiàn)壞死區(qū)域且有大量的膽固醇積累;TCS給藥組斑塊體積不同程度的減少，壞死核心面積減少且膽固醇累積明顯減少。4.主動脈根部橫

5、切面天狼猩紅染色病理切片顯示:模型組斑塊中總膠原量少，Ⅰ型膠原/Ⅲ型膠原的比值小，表明斑塊趨于不穩(wěn)定;與模型組相比，TCS給藥組斑塊中總膠原量較多，Ⅰ型膠原/Ⅲ型膠原的比值大(P＜0.01)，表明斑塊趨于穩(wěn)定。5.主動脈根部橫切面組織免疫熒光觀察結(jié)果顯示，與模型組相比，TCS給藥組主動脈根部與自噬相關(guān)的自噬小體的數(shù)量明顯增多(P＜0.01)，推測其在動脈粥樣硬化中的作用可能與促進自噬有關(guān)。
　　TCS抗動脈粥樣硬化機制研究:體外實

6、驗證明，TCS能夠減少巨噬細胞對脂質(zhì)的吞噬作用，當TCS濃度為50μg/mL時，巨噬細胞對脂質(zhì)的吞噬顯著性減少(P＜0.01)。在12.5μg/mL～50.0μg/mL劑量范圍內(nèi)，能夠顯著減低泡沫細胞的形成率(P＜0.05或P＜0.01)，減低TC含量(P＜0.01）。在mRNA水平上，在12.5μg/mL～50.0μg/mL劑量范圍內(nèi)，清道夫B類受體CD36和清道夫A類受體SR-A1分別最大下調(diào)了56.5％和62.4％，ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)

7、運蛋白A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)和ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白G1(ATP-binding cassette sub-family G member1，ABCG1)分別上調(diào)了3.1倍和1.9倍。在蛋白水平上，在12.5～50.0μg/mL劑量范圍內(nèi)，輕鏈蛋白3(light chain3，LC3)和自噬蛋白beclin1表達量增加，表明TCS能夠促進細胞自噬水平增加。電鏡下觀察，TC

8、S組中自噬小體數(shù)量明顯高于ox-LDL刺激組中自噬小體數(shù)量。激光共聚焦顯微鏡下觀察，TCS組自噬溶酶體/自噬體比值顯著性高于ox-LDL組(P＜0.01)，表明TCS能夠促進自噬溶酶體的形成。
　　結(jié)論:TCS能夠顯著減小主動脈內(nèi)斑塊面積，從而對動脈粥樣硬化發(fā)揮較好治療作用。在細胞水平，TCS能夠減少巨噬細胞對脂質(zhì)的吞噬，減少泡沫細胞的形成;在mRNA水平上，TCS能夠下調(diào)CD36的表達，同時上調(diào)ABCA1、ABCG1的表達;TC