經(jīng)鼻腔給予oxLDL誘導(dǎo)免疫耐受在ApoE---小鼠動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病中作用機(jī)制研究.pdf

1、第一部分經(jīng)鼻腔給予oxLDL誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠免疫耐受模型的建立及評(píng)價(jià)
　　目的:應(yīng)用經(jīng)鼻腔給予氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,oxLDL)法建立ApoE-/-小鼠免疫耐受模型。
　　方法:設(shè)立試驗(yàn)組、免疫對(duì)照組和空白對(duì)照組,前兩組分別經(jīng)鼻腔給予3μg oxLDL和同等體積PBS,每日1次,連續(xù)5次。末次給予oxLDL后的第3天用100μg oxLDL進(jìn)行免疫,免疫二周

2、后摘眼球處死小鼠。應(yīng)用3H-胸腺嘧啶核甘(3H-TdR)滲入法檢測(cè)小鼠oxLDL特異性脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng),應(yīng)用ELISA法和Real-Time RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17及TGF-β含量和mRNA表達(dá)水平,應(yīng)用ELISA法檢測(cè)小鼠血清抗oxLDL抗體水平,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)亞群的變化。
　　結(jié)果:oxLDL刺激后試驗(yàn)組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖效果明顯低

3、于對(duì)照組(p<0.05);試驗(yàn)組脾淋巴細(xì)胞分泌TGF-β量及TGF-β mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(p<0.05),同時(shí)其IFN-γ、IL-4和IL-17 mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組明顯降低,但三組小鼠脾淋巴細(xì)胞的IL-10 mRNA表達(dá)水平?jīng)]有顯著不同(p>0.05);試驗(yàn)組小鼠CD4+CD25+Tregs占CD4+T細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組(p<0.05);另外,與對(duì)照組相比,試驗(yàn)組小鼠血清抗oxLDL抗體水平顯著降低(p<0.05

4、)。
　　結(jié)論:經(jīng)鼻腔多次給予小劑量oxLDL可以成功建立ApoE-/-小鼠免疫耐受模型。
　　第二部分經(jīng)鼻腔給予oxLDL誘導(dǎo)CD4+LAP+和CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制效應(yīng)性T細(xì)胞免疫反應(yīng)及延緩ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展
　　目的:大量研究已證實(shí),動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是一種慢性免疫炎癥性疾病,氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density

5、lipoprotein,oxLDL)特異性T細(xì)胞可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化病變進(jìn)程中炎癥免疫反應(yīng)。經(jīng)口腔多次給予小劑量oxLDL不僅誘導(dǎo)免疫耐受,同時(shí)可顯著抑制AS發(fā)生發(fā)展。然而,粘膜免疫耐受的確切機(jī)制目前仍不清楚,特別是經(jīng)鼻腔誘導(dǎo)免疫耐受。本研究通過經(jīng)鼻腔多次給予小劑量oxLDL對(duì)AS發(fā)生發(fā)展的影響,從而進(jìn)一步闡明粘膜免疫耐受在AS中作用機(jī)制。
　　方法及結(jié)果:6和16周齡的雄性ApoE-/-小鼠經(jīng)鼻腔給予3μg oxLDL,每日一次,

6、連續(xù)五天,高脂喂養(yǎng)誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化形成。經(jīng)鼻腔給予同等體積的PBS液作為對(duì)照組。16及24周齡時(shí),摘眼球處死小鼠,油紅O和HE染色評(píng)估動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積。流式細(xì)胞儀檢測(cè)oxLDL免疫耐受后4和14天小鼠頸淋巴結(jié)和脾臟內(nèi)CD4+LAP+和CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,Tregs)和效應(yīng)性T細(xì)胞(Th-1、-2、-17)的變化;ELISA和Real-Time RT-PCR法檢測(cè)小鼠脾淋巴

7、細(xì)胞分泌細(xì)胞因子(如:IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17和TGF-β)水平和細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平;Real-Time RT-PCR法檢測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和炎癥細(xì)胞標(biāo)志物的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示,經(jīng)鼻腔給予oxLDL誘導(dǎo)免疫耐受顯著抑制動(dòng)脈粥樣硬化的起始(47.6％,p<0.001)和進(jìn)展(21.1％,p=0.001);特別是oxLDL強(qiáng)化免疫耐受能進(jìn)一步抑制動(dòng)脈粥樣硬化病變進(jìn)展(35.8％,p<0.001

8、)。同時(shí),經(jīng)鼻腔給予oxLDL顯著增加小鼠脾臟和頸淋巴結(jié)內(nèi)CD4+LAP+和CD4+CD25+Foxp3+Tregs占CD4+T細(xì)胞百分比,同時(shí)抑制效應(yīng)性T細(xì)胞(如Th1、Th2和Th17)免疫應(yīng)答。
　　結(jié)論:經(jīng)鼻腔多次給予小劑量oxLDL有效抑制AS的發(fā)生發(fā)展,抵抗oxLDL免疫耐受小鼠體內(nèi)TGF-β可顯著增加AS斑塊面積,其可能機(jī)制為小鼠體內(nèi)CD4+LAP+和CD4+CD25+Foxp3+Tregs數(shù)量顯著增加及分泌高水平抗