經鼻腔給予oxLDL誘導免疫耐受在ApoE---小鼠動脈粥樣硬化發(fā)病中作用機制研究.pdf

1、第一部分經鼻腔給予oxLDL誘導ApoE-/-小鼠免疫耐受模型的建立及評價
　　目的:應用經鼻腔給予氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,oxLDL)法建立ApoE-/-小鼠免疫耐受模型。
　　方法:設立試驗組、免疫對照組和空白對照組,前兩組分別經鼻腔給予3μg oxLDL和同等體積PBS,每日1次,連續(xù)5次。末次給予oxLDL后的第3天用100μg oxLDL進行免疫,免疫二周

2、后摘眼球處死小鼠。應用3H-胸腺嘧啶核甘(3H-TdR)滲入法檢測小鼠oxLDL特異性脾淋巴細胞增殖反應,應用ELISA法和Real-Time RT-PCR檢測細胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17及TGF-β含量和mRNA表達水平,應用ELISA法檢測小鼠血清抗oxLDL抗體水平,應用流式細胞術檢測CD4+CD25+調節(jié)性T細胞(Tregs)亞群的變化。
　　結果:oxLDL刺激后試驗組小鼠脾淋巴細胞增殖效果明顯低

3、于對照組(p<0.05);試驗組脾淋巴細胞分泌TGF-β量及TGF-β mRNA表達水平顯著高于對照組(p<0.05),同時其IFN-γ、IL-4和IL-17 mRNA表達水平較對照組明顯降低,但三組小鼠脾淋巴細胞的IL-10 mRNA表達水平沒有顯著不同(p>0.05);試驗組小鼠CD4+CD25+Tregs占CD4+T細胞比例顯著高于對照組(p<0.05);另外,與對照組相比,試驗組小鼠血清抗oxLDL抗體水平顯著降低(p<0.05

4、)。
　　結論:經鼻腔多次給予小劑量oxLDL可以成功建立ApoE-/-小鼠免疫耐受模型。
　　第二部分經鼻腔給予oxLDL誘導CD4+LAP+和CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)性T細胞抑制效應性T細胞免疫反應及延緩ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展
　　目的:大量研究已證實,動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是一種慢性免疫炎癥性疾病,氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density

5、lipoprotein,oxLDL)特異性T細胞可促進動脈粥樣硬化病變進程中炎癥免疫反應。經口腔多次給予小劑量oxLDL不僅誘導免疫耐受,同時可顯著抑制AS發(fā)生發(fā)展。然而,粘膜免疫耐受的確切機制目前仍不清楚,特別是經鼻腔誘導免疫耐受。本研究通過經鼻腔多次給予小劑量oxLDL對AS發(fā)生發(fā)展的影響,從而進一步闡明粘膜免疫耐受在AS中作用機制。
　　方法及結果:6和16周齡的雄性ApoE-/-小鼠經鼻腔給予3μg oxLDL,每日一次,

6、連續(xù)五天,高脂喂養(yǎng)誘導動脈粥樣硬化形成。經鼻腔給予同等體積的PBS液作為對照組。16及24周齡時,摘眼球處死小鼠,油紅O和HE染色評估動脈粥樣硬化斑塊面積。流式細胞儀檢測oxLDL免疫耐受后4和14天小鼠頸淋巴結和脾臟內CD4+LAP+和CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)性T細胞(regulatory T cells,Tregs)和效應性T細胞(Th-1、-2、-17)的變化;ELISA和Real-Time RT-PCR法檢測小鼠脾淋巴

7、細胞分泌細胞因子(如:IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17和TGF-β)水平和細胞因子mRNA表達水平;Real-Time RT-PCR法檢測動脈粥樣硬化斑塊內調節(jié)性T細胞和炎癥細胞標志物的mRNA表達水平。結果顯示,經鼻腔給予oxLDL誘導免疫耐受顯著抑制動脈粥樣硬化的起始(47.6％,p<0.001)和進展(21.1％,p=0.001);特別是oxLDL強化免疫耐受能進一步抑制動脈粥樣硬化病變進展(35.8％,p<0.001

8、)。同時,經鼻腔給予oxLDL顯著增加小鼠脾臟和頸淋巴結內CD4+LAP+和CD4+CD25+Foxp3+Tregs占CD4+T細胞百分比,同時抑制效應性T細胞(如Th1、Th2和Th17)免疫應答。
　　結論:經鼻腔多次給予小劑量oxLDL有效抑制AS的發(fā)生發(fā)展,抵抗oxLDL免疫耐受小鼠體內TGF-β可顯著增加AS斑塊面積,其可能機制為小鼠體內CD4+LAP+和CD4+CD25+Foxp3+Tregs數量顯著增加及分泌高水平抗