動(dòng)脈粥樣硬化的免疫炎癥機(jī)制及三七皂苷的調(diào)控作用.pdf

1、背景與目的：大量的臨床和流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)慢性炎癥患者和自身免疫性疾病患者AS發(fā)病率明顯升高，提示免疫炎癥與動(dòng)脈粥樣硬化存在密切關(guān)系。由于以往的研究所用的模型均缺乏免疫炎癥反應(yīng)直接誘發(fā)AS這種特異性，不能很好的說(shuō)明免疫炎癥反應(yīng)和AS之間的確切關(guān)系。那么究竟免疫炎癥是引起AS的病因還是AS的伴發(fā)現(xiàn)象?這是目前亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。鑒于嚙齒類(lèi)動(dòng)物AS病變更類(lèi)似人類(lèi)，因而制備一種方便可靠的嚙齒類(lèi)動(dòng)物免疫炎癥性AS模型，對(duì)于研究相關(guān)機(jī)制來(lái)說(shuō)是必要的

2、。細(xì)胞因子是免疫炎癥反應(yīng)的代表性產(chǎn)物和刺激物，明確眾多細(xì)胞因子在AS中的變化規(guī)律有助于進(jìn)一步探尋免疫炎癥機(jī)制的作用規(guī)律及其意義?？贵w芯片技術(shù)為此提供了可靠的技術(shù)手段。核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、AP-1是調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子生成的上游共享分子，JNK和p38是與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，因此，明確AS病變中免疫炎癥相關(guān)因子的動(dòng)態(tài)變化及信號(hào)分子NF-κB、AP-1、JNK和p38的變化對(duì)于揭示AS病變的免疫炎癥機(jī)制具有重要意義。三七皂苷

3、具有抗AS的作用，對(duì)多種急慢性炎癥有顯著療效并具有免疫調(diào)節(jié)作用，有理由推測(cè)三七防治AS的機(jī)制與其調(diào)節(jié)免疫炎癥效應(yīng)有關(guān)。因此，通過(guò)采集AS病灶部位及泡沫細(xì)胞中多種化學(xué)信號(hào)分子的動(dòng)態(tài)變化數(shù)據(jù)，不但有助于揭示細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的某些規(guī)律，更重要的是為探索中藥三七防治AS的免疫炎癥調(diào)節(jié)機(jī)制提供極有價(jià)值的線索。 方法： 1、無(wú)菌條件下腹腔注射酵母多糖(Zym)—液體石蠟混懸液20mg/kg體重，間隔5天給藥一次，觀察Zym在大鼠體內(nèi)致炎

4、效果。采用免疫和炎癥刺激的方法(Zym疊加卵蛋白)在高脂喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上誘導(dǎo)大鼠AS的形成，探討免疫炎癥與AS之間的關(guān)系，同時(shí)以求獲得免疫炎癥因素誘導(dǎo)的大鼠AS模型。 2、在我室既往基因芯片檢測(cè)的基礎(chǔ)上，采用細(xì)胞因子抗體芯片并行檢測(cè)免疫炎癥刺激因素下3、6、10周時(shí)形成的AS中炎性相關(guān)因子的動(dòng)態(tài)變化及三七皂苷的影響，以期探索炎癥相關(guān)因子在AS形成過(guò)程中的作用規(guī)律及其意義，為尋找防治AS的分子靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)資料和線索。 3、采用

5、免疫組化方法，檢測(cè)免疫炎癥性AS病變局部3、6、10周時(shí)NFkB/P65、c-Jun/AP-1的動(dòng)態(tài)變化；oxLDL、oxLDL+Zym、oxLDL+Zym+PNS50μg、oxLDL+Zym+PNS100μg分別作用于小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞形成，利用westemblot技術(shù)檢測(cè)JNK和p38磷酸化水平。 結(jié)果： 1、間編5日一次腹腔注射酵母多糖一液體石蠟混懸液20mg/kg，給藥兩次后，白細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示24小時(shí)即

6、明顯升高達(dá)高峰，48小時(shí)-120小時(shí)保持高水平與給藥前比較有顯著差異，144小時(shí)后即二次給藥后6天時(shí)降至正常水平，動(dòng)物無(wú)一死亡。表明此方法可以引發(fā)大鼠體內(nèi)可控制的炎癥反應(yīng)。在高脂飲食的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Zym疊加OVA刺激大鼠10周，模型組大鼠血清總膽固醇及循環(huán)免疫復(fù)合物均明顯高于高脂對(duì)照組，電鏡觀察顯示10周末模型組主動(dòng)脈壁可見(jiàn)血源性泡沫細(xì)胞形成。 2、抗體芯片顯示，3周時(shí)模型組動(dòng)脈壁中IL-1α、MCP-1、TNF-α三種致炎因子

7、處于明顯升高狀態(tài)；PNS可以明顯抑制IL-1a、MCP-1的水平，但對(duì)TNF-α作用不明顯。6周時(shí)有更多的趨化因子表達(dá)增加如CINC-2、CNTF、FKN、LIX，此時(shí)IL-6開(kāi)始升高，PNS對(duì)它們的抑制作用明顯。10周時(shí)，除了一些趨化因子和炎癥免疫因子的增加外，還檢測(cè)到GM-CSF、IFN-γ、Leptin的明顯升高，它們?cè)诖龠M(jìn)泡沫細(xì)胞形成中具有顯著作用，可能是在此前持續(xù)的免疫炎癥反應(yīng)的基礎(chǔ)上最終導(dǎo)致泡沫細(xì)胞形成的關(guān)鍵因素，這與此時(shí)電

8、鏡切片可以觀察到泡沫細(xì)胞相一致。PNS同樣能夠降低三者的水平。在大鼠動(dòng)脈壁泡沫細(xì)胞形成的整個(gè)過(guò)程中，4種細(xì)胞因子處于持續(xù)升高趨勢(shì)，包括CINC-2、CNTF、LIX、VEGF；6種呈現(xiàn)逐漸升高趨勢(shì)，包括CINC-3、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、Leptin、β-NGF；5種因子包括Fractalkine、IL-6、IL-1α、IL-10、TNF-α處于波動(dòng)狀態(tài)；MCP-1在3周時(shí)明顯升高，其它時(shí)相點(diǎn)變化幅度不大，MIP-3a、

9、TIMP-1、IL-4在整個(gè)病變過(guò)程中變化幅度始終較平穩(wěn)。IL-4、IL-10目前被認(rèn)為在AS中是抗炎抗動(dòng)脈硬化的因子，我們發(fā)現(xiàn)除IL-10在6周時(shí)有所升高外均處于降低或變化平穩(wěn)的狀態(tài)。 3、在AS模型大鼠主動(dòng)脈壁中，NF-κB/P65主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)膜下間隙的炎癥細(xì)胞，外膜層亦有少量表達(dá)，胞核可見(jiàn)明顯的陽(yáng)性表達(dá)顆粒。表明這些陽(yáng)性細(xì)胞中NF-κB均處于活化狀態(tài)。模型組3周時(shí)NF-κB即有明顯升高，并隨著病程的進(jìn)展呈進(jìn)行性增

10、高趨勢(shì)，而在高脂對(duì)照組并未呈現(xiàn)出模型組中NF-κB表達(dá)的進(jìn)行性升高趨勢(shì)。c-Jun/AP-1的表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞位于動(dòng)脈壁全層，包括內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)膜下層炎性細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等；并且3周時(shí)c-Jun/AP-1的表達(dá)即呈現(xiàn)明顯升高，此后6、10周時(shí)處于持續(xù)升高狀態(tài)。三七皂苷對(duì)二者的高表達(dá)均有明顯的抑制作用。酵母多醣在體外可以明顯促進(jìn)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的形成，泡沫細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積量也明顯升高并且PNS對(duì)其有明顯的抑制作用，ox-LDL組少量表達(dá)p-p

11、38、p-JNK。oxLDL+Zym組中p-p38、p-JNK的表達(dá)明顯高于ox-LDL對(duì)照組。oxLDL+Zym+PNS501μg組、oxLDL+Zym+PNS100μg組中p-p38、p-JNK的表達(dá)量明顯減少。在檢測(cè)JNK磷酸化的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，僅檢測(cè)出54KD的JNK2，卻沒(méi)有發(fā)現(xiàn)46KD的JNK1。PNS能有效的抑制Zmy對(duì)ox-LDL刺激引起的巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞中p38、JNK的磷酸化的增強(qiáng)作用，并呈劑量依賴性。 結(jié)論

12、： 1、我們應(yīng)用Zym誘發(fā)無(wú)菌性炎癥疊加OVA接種刺激機(jī)體免疫反應(yīng)誘導(dǎo)大鼠動(dòng)脈壁泡沫細(xì)胞形成，成功建立了一種嚙齒類(lèi)(大鼠)免疫炎癥性AS模型，這同時(shí)也證明，除高血脂之外免疫炎癥反應(yīng)也是導(dǎo)致AS的重要原因。 2、抗體芯片檢測(cè)AS病變局部細(xì)胞因子的動(dòng)態(tài)變化顯示，炎癥免疫因素誘發(fā)AS形成的不同階段，由不同的炎癥免疫因子起到主導(dǎo)作用，導(dǎo)致了抗炎和致炎因子的失衡，這可能就是單純控制血脂水平的情況下心血管疾病的發(fā)病率仍在持續(xù)上升以及

13、自身免疫性疾病和慢性炎癥性疾病患者動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病率大幅升高等臨床現(xiàn)象的原因。 3、在免疫炎癥性AS病變中，NF-κB/p65處于進(jìn)行性升高的趨勢(shì)，c-Jun/AP-1在病變的起始階段即明顯升高，并持續(xù)處于高水平。二者的高表達(dá)是免疫炎癥狀態(tài)下細(xì)胞因子紊亂的機(jī)制之一，干預(yù)這兩個(gè)上游共享分子可以調(diào)控紊亂的細(xì)胞因子表達(dá)。 4、p38、JNK的異常激活涉及了oxLDL疊加Zym誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞形成的過(guò)程，其中JNK2是泡沫細(xì)胞形成中

14、JNK活化的主要亞型。表明在免疫炎癥性AS過(guò)程中，活化的JNK和p38可以通過(guò)增強(qiáng)多種轉(zhuǎn)錄因子包括AP-1和NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性而調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的表達(dá)。 5、在免疫炎癥性AS中，由于細(xì)胞因子之間的網(wǎng)絡(luò)作用，如果只單獨(dú)干預(yù)某一個(gè)因子不能產(chǎn)生很好的治療效果。三七皂苷能夠在AS早期階段調(diào)控整體細(xì)胞因子的水平，這可能是其抗AS療效顯著的重要原因。三七皂苷對(duì)NF-κB、AP-1、p38、JNK異常激活的抑制作用可能是其調(diào)控細(xì)胞因子