hsa-miR-181a靶向TLR4調控THP-1巨噬細胞表達炎癥介質.pdf

1、目的：預測并擬定靶向作用于TLR4基因（TLR4 mRNA）的miRNA。觀察所擬定的miRNA對巨噬細胞表達炎癥介質的影響并探討其機制。
　　方法：通過生物信息學方法分析TLR4 mRNA3′端非翻譯區(qū)（3′UTR）序列的二級結構，同時利用在線預測工具預測并結合相關文獻擬定可能靶向作用于TLR4基因的miRNA。通過ELISA測定巨噬細胞培養(yǎng)基中TNF-α、IL-1β、IL-6含量。采用qPCR檢測巨噬細胞內擬定miRNA相對表

2、達量。使用RT-PCR測定巨噬細胞內TLR4、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達水平。通過western blot檢測巨噬細胞內TLR4蛋白水平。運用熒光素酶報告基因技術分析擬定miRNA與TLR4 mRNA的靶向結合活性。
　　結果：⑴經生物信息學預測并結合相關文獻擬定miR-181a作為靶向調控TLR4基因（TLR4 mRNA）的待驗證miRNA。⑵在巨噬細胞被轉染2.5nM、5.0nM、10.0nM的miR-18

3、1a mimic及對照的mimic，待0h、24h、48h、72h后,再分別予LPS刺激(時限為6h)，發(fā)現miR-181a mimic轉染組培養(yǎng)基中TNF-α、IL-1β、IL-6含量均較相應對照組及0h組顯著降低（均P＜0.05），尤其以5.0nM、48h組最為明顯；但當巨噬細胞被轉染2.5nM、5.0nM、10.0nM的miR-181a inhibitor及對照的inhibitor時，0h、24h、48h、72h后,再分別予LPS

4、刺激(時限為6h)，則發(fā)現miR-181a inhibitor轉染組培養(yǎng)基中TNF-α、IL-1β、IL-6含量均較其對照組及0h組顯著升高（均P＜0.05），其中以5.0nM、48h組最為明顯。⑶在巨噬細胞分別被轉染5.0nM的miR-181a mimic（或對照的mimic）和miR-181a inhibitor（或對照的inhibitor）48h，接著予LPS刺激6h后，發(fā)現miR-181a mimic轉染組與其對照組相比，細胞內

5、miR-181a相對表達量顯著升高（P＜0.05），而miR-181a inhibitor轉染組與其對照組相比，細胞內 miR-181a相對表達量顯著降低（P＜0.05），同時發(fā)現miR-181a mimic和miR-181a inhibitor處理組與各自對照組相比，細胞內TLR4 mRNA表達水平均無顯著差異（均P＞0.05），但miR-181a mimic處理組與其對照組相比，細胞內TLR4蛋白水平及TNF-α、IL-1

6、β、IL-6 mRNA表達水平均顯著降低（均P＜0.05），而miR-181a inhibitor處理組與其對照組相比，細胞內TLR4蛋白水平及TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達水平均顯著升高（均P＜0.05）。⑷通過熒光素酶報告基因技術發(fā)現：miR-181a mimic轉染組T293細胞內熒光素酶活性顯著低于對照組（P＜0.05）；miR-181a mimic+miR-181a inhibitor共轉染組T293細胞內熒光