miR-20a-b靶向沉默ABCA1對(duì)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)的影響.pdf_第1頁(yè)
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1、動(dòng)脈粥樣硬化性疾病嚴(yán)重危害人類健康。泡沫細(xì)胞的形成在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。所以,有效的阻止泡沫細(xì)胞,是防治動(dòng)脈粥樣硬化有效手段。
  動(dòng)脈粥樣硬化的的嚴(yán)重程度和血清高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的含量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。HDL-C拮抗動(dòng)脈粥樣硬化的主要機(jī)制在于參與膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)(RCT)過(guò)程。RCT的定義是,HDL把外周組織中過(guò)剩的膽固醇,轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟,經(jīng)過(guò)代謝后變?yōu)槟懼崤懦鲶w外的過(guò)程,能夠阻止生成泡沫細(xì)胞,是較為公認(rèn)

2、的,防止動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制之一。在RCT過(guò)程中,細(xì)胞內(nèi)膽固醇、磷脂通過(guò)三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ABCA1)轉(zhuǎn)移給apoA-I,它是HDL前體,新生成HDL,開(kāi)始RCT過(guò)程,所以在RCT和新生成HDL中, ABCA1起著起始和限速作用。如果可以調(diào)節(jié) ABCA1蛋白的表達(dá),就可以調(diào)節(jié)RCT,可以調(diào)控動(dòng)脈粥樣硬化。
  MicroRNA(miRNA)是一類高度保守的,長(zhǎng)度一般在22個(gè)核苷酸左右,單鏈形式存在的,非編碼的RNA。miRN

3、A與靶基因mRNA的3’非編碼區(qū)(UTR)互補(bǔ)結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄后水平直接降解靶基因mRNA或抑制蛋白質(zhì)翻譯。一個(gè)靶基因能夠被多個(gè)miRNA與其3’UTR特異結(jié)合來(lái)調(diào)控。因此,miRNA作為一類非常重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子,與體內(nèi)代謝、增殖等病理生理過(guò)程起著重要作用,了解其詳細(xì)的調(diào)控機(jī)制,對(duì)疾病的發(fā)生和防治非常有意義。最近國(guó)內(nèi)外學(xué)者陸續(xù)發(fā)現(xiàn)多個(gè)miRNA可調(diào)控ABCA1。在巨噬細(xì)胞、肝細(xì)胞和動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型中, miR-33、 miR-758

4、、miR-106b、miR-27和miR-19b等miRNA可與ABCA1靶向結(jié)合,起到調(diào)節(jié)ABCA1的作用和調(diào)控動(dòng)脈粥樣硬化的作用,提示miRNA已成為動(dòng)脈粥樣硬化防治的重要靶點(diǎn)。
  有研究表明,人動(dòng)脈粥樣硬化腹主動(dòng)脈瘤組織與人正常血管組織比較,miR-20a明顯升高。臨床數(shù)據(jù)顯示,冠心病患者血清中miR-20a表達(dá)較正常健康人群降低。糖尿病患者血清miR-20b較正常健康者降低。提示miR-20a/b與動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病有

5、著密切的關(guān)系,但是miR-20a/b在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展中的具體機(jī)制尚未明了。我們利用生物信息學(xué)靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站發(fā)現(xiàn),miR-20a/b序列高度保守,并且miR-20a/b可與ABCA1的3’UTR靶向結(jié)合,并且二者結(jié)合自由能較低,提示結(jié)合較穩(wěn)定。
  ABCA1的3’UTR較長(zhǎng)再結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果,我們推測(cè): miR-20a/b可能通過(guò)與ABCA1的3’UTR靶向結(jié)合,ABCA1的翻譯過(guò)程受到抑制,使ABCA1蛋白的表達(dá)減

6、少,RCT效率降低,促使發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化;miR-20a/b是一個(gè)可以對(duì)ABCA1起抑制作用新的miRNA。
  為驗(yàn)證以上假說(shuō),我們擬采用以下方案進(jìn)行:
  1、采用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)分析miR-20a/b與ABCA13’UTR的直接結(jié)合作用;
  2、過(guò)表達(dá)或沉默THP-1源性、RAW264.7源性泡沫細(xì)胞的miR-20a/b,觀察細(xì)胞ABCA1表達(dá)水平、膽固醇與膽固醇酯含量及膽固醇流出率,離體研究miR-20a

7、/b對(duì)RCT的影響;
  3、過(guò)表達(dá)或沉默apoE基因敲除鼠miR-20a/b,觀察對(duì)ABCA1表達(dá)水平、在體RCT效率、HDL-C水平、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積的影響,在體研究miR-20a/b對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的影響。
  4、臨床研究,比較冠心病患者與正常非冠心病體檢者,miR-20a/b的表達(dá)情況。
  第一部分生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-20a/b與ABCA1靶向結(jié)合
  目的:
  生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和

8、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,miR-20a/b與ABCA1靶向結(jié)合的情況。
  方法:
  在線打開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù) miRNAbase,輸入miR-20a/b查詢其序列。ABCA1的3’UTR序列在GeneBank中輸入查詢獲得。利用生物信息學(xué)在線預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)分析miR-20a/b與 ABCA13’UTR的結(jié)合位點(diǎn)及結(jié)合自由能情況。然后進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn),首先PCR法擴(kuò)增THP-1單核細(xì)胞 ABCA1的3’UTR,然后將野生型 ABCA13’

9、UTR或突變型ABCA13’UTR重組熒光素酶質(zhì)粒和miR-20a/b mimic共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞,最后檢測(cè)熒光素酶的活性。
  結(jié)果:
  成功獲取miR-20a/b序列和ABCA1的3’UTR序列。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR-20a/b序列高度保守, miR-20a/b的種子序列與ABCA1的3’UTR序列完全配對(duì),并且預(yù)測(cè)二者結(jié)合的自由能低,所預(yù)測(cè)分?jǐn)?shù)很高。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí),與con miR組比較,miR-2

10、0a/b可降低野生型ABCA1的3’UTR共轉(zhuǎn)染后熒光素酶活性,而不影響突變型ABCA1的3’UTR共轉(zhuǎn)染后熒光素酶活性。
  結(jié)論:
  生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí) miR-20a/b可與 ABCA1的3’UTR靶向結(jié)合。
  第二部分 miR-20a/b靶向沉默泡沫細(xì)胞ABCA1表達(dá)對(duì)膽固醇流出的影響
  目的:
  離體研究 miR-20a/b對(duì) THP-1源性泡沫細(xì)胞和 RAW264.

11、7源性泡沫細(xì)胞ABCA1 mRNA和蛋白表達(dá),及巨噬細(xì)胞膽固醇流出率和細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的影響。
  方法:
  利用THP-1單核細(xì)胞經(jīng)PMA分化為巨噬細(xì)胞,或常規(guī)培養(yǎng)RAW264.7巨噬細(xì)胞,然后給予ox-LDL誘導(dǎo)上述巨噬細(xì)胞為泡沫細(xì)胞。使用Lipo RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑將下述各組干預(yù)因素轉(zhuǎn)染至以上兩種泡沫細(xì)胞,分為以下7組:
 ?。?)對(duì)照組:正常泡沫細(xì)胞組;
 ?。?)mimic con組:40nM m

12、imic con培養(yǎng)24h。
 ?。?)miR-20a mimic組:40nM miR-20a mimic培養(yǎng)24h。
 ?。?)miR-20b mimic組:40nM miR-20b mimic培養(yǎng)24h。
  (5)inhibitor con組:40nM inhibitor con培養(yǎng)24h。
  (6)miR-20a inhibitor組:40nM miR-20a inhibitor培養(yǎng)24h。
  

13、(7)miR-20b inhibitor組:40nM miR-20b inhibitor培養(yǎng)24h。
  檢測(cè)ABCA1 mRNA和蛋白的表達(dá),使用real-time PCR和western blot法;然后測(cè)定 THP-1和RAW264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出率,使用液體閃爍儀;高效液相色譜檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量。
  結(jié)果:
  與對(duì)照組比較,miR-20a/b mimic組ABCA1的mRNA和蛋白的表達(dá)減少,mi

14、R-20a/b inhibitor組ABCA1的mRNA和蛋白的表達(dá)增加,而mimic control和inhibitor control組ABCA1的表達(dá)無(wú)明顯變化。與對(duì)照組比較,miR-20a/b mimic組THP-1源性和RAW264.7源性泡沫細(xì)胞膽固醇流出率降低,細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量增加,而miR-20a/b inhibitor組細(xì)胞膽固醇流出率增加,細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量降低。
  結(jié)論:
  miR-20a/b抑制泡沫

15、細(xì)胞ABCA1的表達(dá),減少細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出,增加細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量,有利于泡沫細(xì)胞形成;miR-20a/b inhibitor可促進(jìn)泡沫細(xì)胞ABCA1表達(dá),增加細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出,減少細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量,抑制泡沫細(xì)胞形成。
  第三部分 miR-20a/b對(duì)apoE-/-動(dòng)脈粥樣硬化小鼠ABCA1的表達(dá)及動(dòng)脈粥樣硬化的影響
  目的:
  在體研究miR-20a/b對(duì)apoE-/-動(dòng)脈粥樣硬化小鼠ABCA1的表達(dá),及動(dòng)脈粥樣

16、硬化的影響。
  方法:
  給予雄性apoE-/-小鼠喂養(yǎng)高脂飲食(21%豬油+0.21%膽固醇)10周造動(dòng)脈粥樣硬化模型,皮下注射化學(xué)修飾后miRNA或anti-miRNA,分為以下7組:
 ?。?)PBS組:給予與miR-20a等體積的PBS;
 ?。?)con miR組:給予10mg/kg的conrol miRNA;
  (3) miR-20a組:給予10mg/kg的miR-20a agomir;<

17、br> ?。?) miR-20b組:給予10mg/kg的miR-20b agomir;
 ?。?)con anti-miR組:給予10mg/kg的conrol anti-miRNA;
 ?。?)anti-miR-20a組:給予10mg/kg的anti-miR-20a;
 ?。?)anti-miR-20b組:給予10mg/kg的anti-miR-20a。
  檢測(cè)小鼠肝臟ABCA1 mRNA和蛋白的表達(dá),使用rea

18、l-time PCR和western blot法。腹腔注射3H-膽固醇RAW264.7巨噬細(xì)胞,48h后收集小鼠的血清、肝臟及48h糞便,用液體閃爍計(jì)數(shù)測(cè)定 RAW264.7巨噬細(xì)胞在體膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)效率;酶氧化法檢測(cè)甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和總膽固醇等血脂水平;檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈動(dòng)脈粥樣硬化病變程度,使用油紅O病理染色和HE病理染色。
  結(jié)果:
  miR-20a/b

19、抑制apoE-/-動(dòng)脈粥樣硬化小鼠肝臟ABCA1的mRNA和蛋白的表達(dá),降低小鼠血清、肝臟、糞便的3H-膽固醇含量,使HDL-C水平下降,LDL-C含量升高,最終使得主動(dòng)脈動(dòng)脈粥樣硬化程度加重;而anti-miR-20a/b上調(diào)apoE-/-動(dòng)脈粥樣硬化小鼠肝臟ABCA1的mRNA和蛋白的表達(dá),增加小鼠血清、肝臟、糞便的3H-膽固醇含量,增加小鼠HDL-C水平,降低LDL-C水平,減輕主動(dòng)脈動(dòng)脈粥樣硬化病變程度。
  結(jié)論:

20、>  miR-20a/b可通過(guò)靶向沉默ABCA1的表達(dá),影響血脂水平,加重動(dòng)脈粥樣硬化病變;Anti-miR-20a/b可促進(jìn)ABCA1的表達(dá),改善血脂水平,減輕動(dòng)脈粥樣硬化病變,為動(dòng)脈粥樣硬化的治療提供新的思路。
  第四部分冠心病患者血清miR-20a/b的表達(dá)及意義
  目的:
  研究冠心病患者血清miR-33和miR-20a/b的表達(dá)情況,初步闡明miR-20a/b在冠心病患者中的臨床意義。
  方法:

21、
  收集山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心血管內(nèi)科冠脈造影證實(shí)的冠心病患者40例,所有患者無(wú)高血壓病、無(wú)糖尿病、LDL小于3.12 mmol/L為冠心病組;收集社區(qū)正常體檢人群,無(wú)高血壓病、無(wú)糖尿病、LDL小于3.12 mmol/L的正常體檢人群40例為對(duì)照組。采用生化試劑盒檢測(cè)相關(guān)生化指標(biāo),用Real time PCR法檢測(cè)miR-33和miR-20a/b的表達(dá)。對(duì)miR-33和miR-20a/b與HDL,LDL進(jìn)行相關(guān)性分析,后進(jìn)行非條

22、件logistic回歸多因素分析miR-33和miR-20a/b是否為冠心病獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
  結(jié)果:
  與健康對(duì)照組比較,冠心病組吸煙比例和飲酒比例較對(duì)照組高,BMI高,而HDL-C低。冠心病組miR-33和miR-20a/b表達(dá)均降低。對(duì)miR-33和miR-20/b與HDL-C與LDL-C相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),對(duì)照組,miR-33和miR-20a/b與HDL-C成負(fù)相關(guān),但miR-33無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,miR-20a/b有統(tǒng)計(jì)

23、學(xué)意義。對(duì)照組三個(gè)miRNA與LDL相關(guān)性均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。冠心病組,miR-33、miR-20a/b與HDL成正相關(guān),miR-20a與miR-33有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,miR-20b無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。冠心病組僅miR-20a與LDL成負(fù)相關(guān),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。多因素分析發(fā)現(xiàn),BMI,吸煙,miR-33和miR-20a是冠心病的獨(dú)立影響因素,但吸煙和miR-33的OR95%可信區(qū)間包括了1。
  結(jié)論:
  冠心病患者miR-33和miR-2

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