脂聯(lián)素對(duì)巨噬細(xì)胞膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)的影響及其機(jī)制.pdf

1、當(dāng)前，在全世界范圍內(nèi)，心血管疾病的發(fā)病率和死亡率均位于前幾位，對(duì)人們的身心健康有著重大威脅。目前我國(guó)罹患心血管病者約2.3億人，其中約300萬(wàn)人因該病死亡。在心腦血管病變中動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）為關(guān)鍵的病理基礎(chǔ)，以膽固醇代謝異常為主的脂質(zhì)代謝紊亂是重要的致病因素；該疾病最主要的病理特點(diǎn)是巨噬細(xì)胞能清除高水平的脂質(zhì)產(chǎn)生泡沫細(xì)胞?；谝陨媳尘埃芯空邆儫嶂杂谔接憚?dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)生發(fā)展機(jī)制、怎樣避免形成泡沫細(xì)

2、胞。
　　膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)（Reverse Cholesterol ransport，RCT）指的是把細(xì)胞中含有的游離性膽固醇向胞外轉(zhuǎn)移，并聚集至肝臟，最終排出機(jī)體；RCT全過(guò)程包括下列各步驟：最初外周細(xì)胞內(nèi)含有大量膽固醇經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（如ABCA1和ABCG1等）的介導(dǎo)進(jìn)而結(jié)合于載脂蛋白，生成成熟狀態(tài)的HDL，再隨著血液系統(tǒng)聚集到肝臟，最后排出機(jī)體。ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子(Binding Cassette Transporter，ABC)屬

3、于當(dāng)前存在的數(shù)量最多的膜轉(zhuǎn)運(yùn)家族。其中ATP三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子A1（ABCA1）是轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)功能最突出的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，有助于細(xì)胞排出膽固醇。在ABCA1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用下脂質(zhì)可發(fā)生外流，再結(jié)合于apoA-I，進(jìn)而產(chǎn)生一定水平的磷脂-apoA-I復(fù)合物，并且能夠酯化細(xì)胞外游離狀態(tài)的膽固醇，最終可生成成熟狀態(tài)的HDL，隨著血液系統(tǒng)聚集在肝臟中，進(jìn)而能夠被肝臟所利用而生成膽汁酸鹽，和糞便排出體外P[1-3]P P。所以，提升RCT水平有助于防止AS

4、病變。
　　相關(guān)的研究結(jié)果表明，高密度脂蛋白(High Density Lipoprotein Cholesterol,HDL-C)數(shù)量與機(jī)體發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化的可能性呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。HDL-C拮抗動(dòng)脈粥樣硬化的主要機(jī)制在于介導(dǎo)RCT過(guò)程。其中RCT能將外周組織內(nèi)含有的大量膽固醇通過(guò)HDL-C轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟以膽汁酸的形式排出體外，是目前相關(guān)領(lǐng)域研究者們公認(rèn)的抗動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵機(jī)制。在RCT中ABCA1有利于細(xì)胞中磷脂、膽固醇向HD

5、L-C前體apoA-I轉(zhuǎn)運(yùn)，形成新生HDL-C，進(jìn)而啟動(dòng)RCT，所以ABCA1在RCT和HDL-C新生成中起著極其重要的起始限速作用。所以能否通過(guò)調(diào)節(jié)ABCA1蛋白的表達(dá)而達(dá)到促進(jìn)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)成為廣受關(guān)注的抗動(dòng)脈粥樣硬化的靶點(diǎn)。
　　脂聯(lián)素(Adiponectin)主要來(lái)源于脂肪細(xì)胞，能夠發(fā)揮胰島素抵抗、抗動(dòng)脈粥樣硬化及抗炎等作用。研究表明：在肥胖、高血壓、糖尿病、心肌受損、動(dòng)脈粥樣硬化等病人血清內(nèi)具有較低水平的脂聯(lián)素。并且，很多

6、臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示脂聯(lián)素濃度明顯降低與高血壓、血管內(nèi)皮受損、冠心病及心肌梗死等病變的發(fā)生發(fā)展存在緊密的聯(lián)系[4]。在發(fā)生AS疾病的過(guò)程中，脂聯(lián)素能夠?qū)ρ芷交〖?xì)胞的分化、繁殖進(jìn)行抑制，并避免巨噬細(xì)胞不斷轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，使脂聯(lián)素在內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)揮抗AS功效。
　　脂聯(lián)素對(duì)巨噬細(xì)胞膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)的影響及其機(jī)制在\在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化AS早期內(nèi)皮細(xì)胞可被炎癥細(xì)胞激活在血管壁上沉積并呈劑量依賴性抑制TNF誘導(dǎo)的在人體主動(dòng)脈內(nèi)皮上的細(xì)胞粘附作用當(dāng)

7、發(fā)生動(dòng)脈硬化或其他大血管病變時(shí)大量的脂聯(lián)素會(huì)聚集在受損的血管壁上而導(dǎo)致患者脂聯(lián)素的消耗血漿脂聯(lián)素隨著動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展呈進(jìn)行性下降低脂聯(lián)素血癥是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因子脂聯(lián)素缺乏小鼠在動(dòng)脈發(fā)生損傷的時(shí)候表現(xiàn)為嚴(yán)重的內(nèi)膜增厚使用外源性脂聯(lián)素可使內(nèi)膜增殖得到改善男性的脂聯(lián)素往往低于女性有人認(rèn)為這可能是女性冠心病發(fā)病率低于男性的一個(gè)原因最近發(fā)生過(guò)心血管疾病患者脂聯(lián)素水平降低脂聯(lián)素每升高1μg/ml心血管的危險(xiǎn)性則下降3％脂聯(lián)素可降低

8、腫瘤壞死因子TNF-α刺激的粘附分子的表達(dá)抑制外周單核細(xì)胞的生長(zhǎng)和炎癥因子的釋放具有保護(hù)內(nèi)皮抗炎拮抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用它的水平與甘油三酯載脂蛋白呈負(fù)相關(guān)與高密度脂蛋白及載脂蛋白A-I呈正相關(guān)。
　　本課題通過(guò)細(xì)胞水平和動(dòng)物水平兩個(gè)部分來(lái)探討脂聯(lián)素對(duì)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。選擇脂聯(lián)素基因敲除小鼠(Adiponectin-/-GeneKnockOutMice)作為研究動(dòng)物，連續(xù)8周堅(jiān)持高脂飼養(yǎng)，建立動(dòng)脈粥樣硬化模型。對(duì)脂聯(lián)素組動(dòng)物血脂水平

9、改變情況進(jìn)行檢測(cè)；小鼠注射3H-TC后，經(jīng)液閃計(jì)數(shù)儀對(duì)脂聯(lián)素處理后動(dòng)物肝臟、血清、糞便內(nèi)含有的膽固醇流出量進(jìn)行檢測(cè)；經(jīng)Western-blot、PCR法對(duì)脂聯(lián)素處理后動(dòng)物ABCA1的mRNA水平、蛋白量進(jìn)行檢測(cè)，深入的分析脂聯(lián)素對(duì)RCT產(chǎn)生的影響和相關(guān)的作用機(jī)理，為臨床上有效的防止疾病的發(fā)生發(fā)展給予一個(gè)新方向、新思路。
　　1、脂聯(lián)素通過(guò)肝X受體α信號(hào)通路上調(diào)RAW264.7巨噬細(xì)胞中ABCA1、ABCG1的表達(dá)及意義
　　

10、目的：
　　離體研究脂聯(lián)素APN是否是通過(guò)肝X受體α信號(hào)通路影響RAW264.7源性泡沫細(xì)胞內(nèi)含有的ABCA1、ABCG1表達(dá)的mRNA水平、蛋白量、膽固醇流出量、膽固醇總水平。
　　方法：
　　T培養(yǎng)RAW264.7巨噬細(xì)胞給予ox-LDL誘導(dǎo)為泡沫細(xì)胞。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和westernblot檢測(cè)ABCA1、ABCG1mRNA和蛋白的表達(dá)；液體閃爍計(jì)數(shù)測(cè)定荷脂THP-1巨噬細(xì)胞和RAW264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固

11、醇流出率；高效液相色譜法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量。
　　結(jié)果：
　　T脂聯(lián)素通過(guò)LXRα信號(hào)通路上調(diào)RAW264.7巨噬細(xì)胞中ABCA1、ABCG1表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　脂聯(lián)素通過(guò)LXRα途徑提高RAW264.7巨噬細(xì)胞中的ABCA1、ABCG1表達(dá)和膽固醇流出。為預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化提供了理論基礎(chǔ)。
　　2、脂聯(lián)素對(duì)APN-/-動(dòng)脈粥樣硬化小鼠ABCA1表達(dá)及動(dòng)脈粥樣硬化的影響
　　目的：
　

12、　研究脂聯(lián)素對(duì)脂聯(lián)素基因敲除小鼠（APN-/-小鼠）體內(nèi)巨噬細(xì)胞膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)的影響及其在抗動(dòng)脈粥樣硬化中可能的作用機(jī)制。
　　1.觀察脂聯(lián)素對(duì)ApoE-/-小鼠頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的作用；
　　2.探討脂聯(lián)素對(duì)斑塊內(nèi)硝基化應(yīng)激的作用及其可能機(jī)制；
　　3.觀察脂聯(lián)素對(duì)斑塊局部血流剪切力的影響,探討其抑制斑塊的其他可能機(jī)制。
　　方法：
　　1.模型建立：選擇4周齡脂聯(lián)素基因敲除小鼠（Adiponectin-/

13、-geneknockoutmice）30只，高脂喂養(yǎng)8周，建立動(dòng)脈粥樣硬化模型。
　　2.分組：動(dòng)物隨機(jī)分為五組：空白對(duì)照組，50μg/（kg·d）干預(yù)組，150μg/（kg·d）干預(yù)組，200μg/（kg·d）干預(yù)組，250μg/（kg·d）干預(yù)組。
　　3.方法：脂聯(lián)素干預(yù)4周后，向APN-/-小鼠腹腔注射乙?；疞DL與3H‐TC標(biāo)記的RAW264.7巨噬細(xì)胞懸液，酶法測(cè)定小鼠血清血脂水平，液閃計(jì)數(shù)儀測(cè)定小鼠肝臟、血清及

14、糞便中3PH‐TC占腹腔注射P3PPH‐TC總量的百分比，RT-PCR及Western-blot檢測(cè)肝臟中ABCA1的mRNA及蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.與對(duì)照組相比，脂聯(lián)素干預(yù)組血清TG、TC、LDL水平明顯降低，HDL升高；且此改變隨脂聯(lián)素呈劑量依賴性改變。
　　2.對(duì)照組主動(dòng)脈粥樣硬化病變明顯，光鏡下可見(jiàn)血管壁有大量脂質(zhì)沉積，有粥樣斑塊形成，有散在泡沫細(xì)胞；脂聯(lián)素干預(yù)組APN-/-小鼠的主動(dòng)脈粥樣硬化病

15、變程減輕，且隨脂聯(lián)素呈劑量依賴性改變。
　　3.脂聯(lián)素干預(yù)組血清P3PPH‐TC含量明顯降低(P<0.05)，肝臟及糞便中PP3PH‐TC含量明顯升高(P<0.05)。
　　4.RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，脂聯(lián)素干預(yù)組肝臟組織ABCA1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯提高，且隨脂聯(lián)素呈劑量依賴性增加(P<0.05)。
　　5.Western-blot結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，使用脂聯(lián)素干預(yù)的實(shí)驗(yàn)組肝臟組織ABCA1的蛋

16、白表達(dá)水平明顯提高，且隨脂聯(lián)素呈劑量依賴性增加(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.脂聯(lián)素能夠降低血清TC、TG及LDL水平，提高HDL水平；
　　2.脂聯(lián)素可以減輕小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化；
　　3.脂聯(lián)素可以增加血清膽固醇流出率；
　　4.脂聯(lián)素能夠呈劑量依賴性上調(diào)肝臟組織中ABCA1的mRNA及蛋白表達(dá)。
　　脂聯(lián)素通過(guò)上調(diào)ABCA1來(lái)促進(jìn)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出，從而延緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)