模擬失重條件下骨相關細胞因子對前成骨細胞的調(diào)控作用研究.pdf

1、中長期空間飛行導致機體發(fā)生的骨丟失等航天醫(yī)學問題，已經(jīng)成為人類向更深、更遠、更高的外層空間探索的制約因素之一。目前空間飛行采取的運動鍛煉、藥物預防和營養(yǎng)補充都不能有效防止骨丟失的發(fā)生發(fā)展；為了確保航天員在未來長期飛行任務中健康、高效工作，需要在細胞分子水平闡明空間骨丟失的發(fā)生機制；發(fā)展基于細胞分子本質認識的有效對抗防護措施。這是載人航天發(fā)展的迫切和必然要求。
　　空間骨丟失是航天員在太空易患疾病的首要風險因素，其發(fā)生的主要原因是骨

2、形成減少。失重不但影響成骨細胞的分化進程，還影響其分化起始。啟動和調(diào)控成骨細胞分化的關鍵轉錄因子Cbfa1，也是一個力信號傳導的靶分子。骨相關細胞因子參與了成骨細胞的增殖、分化調(diào)節(jié)，包括對Cbfa1活性的調(diào)節(jié)。失重影響多個骨相關細胞因子的表達和信號傳導。因此，闡明失重條件下骨相關細胞因子在骨丟失中的作用，對骨丟失機制的闡明和發(fā)展有效對抗防護措施具有重要意義。
　　前期研究表明失重條件下，骨相關細胞因子對BMSC和前成骨細胞的增殖、

3、分化的促進作用減弱，使成骨細胞數(shù)量減少和活性下降，導致骨形成減弱，進而發(fā)生骨質丟失。因此，本研究構建了能用報告基因反映Cbfa1活性的成骨細胞模型和IGF-I選擇性剪接模型；采用細胞回轉、大鼠尾吊和液流剪切等力刺激模型；研究骨相關細胞因子對BMSC增殖、對前成骨細胞Cbfa1活性的影響及可能的機制，觀察尾吊大鼠骨骼組織中IGF-I基因表達和調(diào)控變化；旨在探討骨相關細胞因子在失重條件下表達、調(diào)控和作用的變化，為闡明空間骨丟失的細胞分子機制

4、提供科學依據(jù)。
　　實驗方法：(1)采用基于紅細胞裂解的全骨髓培養(yǎng)法分離培養(yǎng)BMSC，通過亞甲基藍染色和流式細胞儀檢測，觀察回轉對BMSC增殖、細胞周期及對細胞因子促增值效應的影響；采用免疫熒光染色、RT-PCR、Western、基因芯片方法，研究回轉對BMSC微絲骨架、ERK1/2活性、成骨向分化、基因表達譜的影響。(2)通過載體構建和穩(wěn)定轉染，構建用報告基因反映成骨細胞Cbfa1活性的模型，通過EGFP的熒光強度半定量分析或L

5、uc酶活性分析，研究不同重力、VD3和BMP2對Cbfa1活性的影響以及回轉條件下Cbfa1對VD3和BMP2的響應特征；通過雙向CO-IP，觀察回轉和超重條件下VDR與Cbfa1相互作用的變化；采用微絲骨架破壞劑CB和穩(wěn)定劑JAS，研究細胞微絲骨架在BMP2誘導Cbfa1活性中的作用。(3)利用細胞回轉和大鼠尾吊模型，采用RT-qPCR方法，研究回轉和不同尾吊時間對成骨細胞、骨骼組織IGF-I選擇性剪接異構體表達的影響；通過PCR擴增

6、和基因亞克隆，構建了4個含IGF-I外顯子5及兩側不同長度內(nèi)含子的選擇性剪接載體，分別穩(wěn)定轉染到MC3T3-E1中，建立IGF-I選擇性剪接模型；利用流體剪切實驗系統(tǒng)；觀察1Pa剪切力刺激1小時對IGF-I選擇性剪接的影響。
　　結果發(fā)現(xiàn)：(1)回轉破壞細胞微絲骨架，并具有時間依賴性；使G1/G0期的細胞數(shù)量增加，由86.6％增加到91.4％，從而抑制了BMSC增殖；降低了信號分子ERK1/2活性和細胞因子IGF-I、EGF和bF

7、GF對BMSC的促增殖作用，促增殖效應分別由15.5％、16.3％和26.9％下降到10.5％、10.3％和19.6％；抑制了BMSC的成骨向分化潛能；基因表達譜和功能聚類分析表明與細胞周期、微絲骨架、成骨細胞分化相關基因的表達發(fā)生了改變，且表達升高的負調(diào)控基因占多數(shù)。(2)建立了能用EGFP或Luc報告基因反映Cbfa1活性的成骨細胞模型；發(fā)現(xiàn)回轉抑制Cbfa1活性，而超重能提高Cbfa1活性；VD3和BMP2均可提高Cbfa1的活性

8、，但回轉可降低VD3和BMP2對Cbfa1活性的刺激作用，回轉條件下VD3和BMP2誘導的Cbfa1活性增加分別由79％和18％下降到43％和14％，同時VD3受體VDR與Cbfa1之間的相互作用受到抑制；回轉可破壞MG63的微絲骨架；低濃度微絲骨架破壞劑CB(0.5nmol/L)降低了BMP2對Cbfa1活性的增強作用，而微絲骨架穩(wěn)定劑JAS在一定程度上能保護BMP2對Cbfa1活性的刺激作用。(3)大鼠尾吊降低骨骼組織IGF-IEa

9、和MGF的表達，且具有時間依賴性；使血清中IGF-I水平下降。篩選出了4個分別穩(wěn)定轉染含外顯子5及兩側不同長度內(nèi)含子的IGF-I選擇性剪接載體的細胞株；1Pa流體力能顯著提高穩(wěn)定轉染p5341選擇性剪接載體細胞株的MGF-EGFP表達，而對其他細胞株沒有影響。
　　結論：回轉抑制了BMSC的增殖和骨向分化潛能，降低其對細胞因子IGF-I、EGF和bFGF的響應性?；剞D通過削弱VDR與Cbfa1之間的相互作用，降低了VD3對Cbfa