JAB1對炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的調(diào)控作用研究.pdf

1、本單位以往研究發(fā)現(xiàn)：嚴(yán)重創(chuàng)傷后糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoidreceptor，GR)功能受到嚴(yán)重抑制，使糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)的抗炎作用受限；而核因子кB(NF-кB)功能顯著活化，促進炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生，因而產(chǎn)生了GR受抑制、NF-кB活化、炎性細(xì)胞因子釋放增加的級聯(lián)式放大效應(yīng)，這與全身性炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，進一步發(fā)展可能導(dǎo)致多器官功能不全綜合癥(MODS)發(fā)生。在此過程

2、中，炎性因子釋放增加對創(chuàng)傷后繼發(fā)全身性損害的發(fā)生、發(fā)展起到了重要作用，如果能夠有效控制炎性因子的產(chǎn)生，將會對機體的恢復(fù)產(chǎn)生積極作用。 已有資料表明，GR和NF-кB都是多種炎性細(xì)胞因子的上游核轉(zhuǎn)錄因子，它們對炎性因子的產(chǎn)生起著相反的調(diào)控作用：GR具有顯著的抗炎作用，能夠抑制多種炎性因子(如IL-6、TNF-α等)的產(chǎn)生；而NF-кB具有明顯的致炎作用，通過抑制NF-кB的活化，能顯著抑制炎性因子的表達(dá)和釋放。JABl又名c-Ju

3、n結(jié)合蛋白(c-Jun-activation-domainbindingprotein1)，是38kD左右的可溶性核蛋白，是COP9信號體(COP9signalosomeregulatorycomplex)的第5個亞單位。JABl能與多種蛋白相互作用，是多種蛋白的輔活化子，是一種重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。國外有文獻(xiàn)報道，JAB1是NF-кB的輔活化子，可上調(diào)其核轉(zhuǎn)錄功能。而本單位新近的研究中，通過酵母雙雜交法篩選到多個與GR結(jié)合的分子，JAB

4、l便是其中之一。隨后又運用體外轉(zhuǎn)錄激活報告質(zhì)粒分析系統(tǒng)對GR的轉(zhuǎn)錄激活能力進行了分析，證實JABl能增強GR的轉(zhuǎn)錄激活活性，隨著實驗中JABl表達(dá)的增強，GR的轉(zhuǎn)錄激活活性會顯著增加。由此看來，JABl有可能既是NF-кB的輔活化子，又是GR的輔活化子，但是它在炎癥反應(yīng)中究竟起到何種作用，目前尚未見明確報道。為此，本課題在海外青年學(xué)者合作研究項目的資助下，重點觀察巨噬細(xì)胞低表達(dá)JABl條件下對炎性細(xì)胞因子生成的影響，從而闡明JABl在炎

5、癥反應(yīng)中的作用。 RNA干擾作為抑制特異基因表達(dá)的重要手段，可以簡單、有效、特異的下調(diào)細(xì)胞中靶基因的表達(dá)，目前已經(jīng)被廣泛用于基因功能的實驗研究中。為了探討細(xì)胞受細(xì)菌內(nèi)毒素(LPS)刺激后JABl的主要功能，本課題以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7為研究對象，通過RNA干擾抑制JABl的表達(dá)，旨在觀察在低表達(dá)JABl條件下，細(xì)胞在LPS刺激時炎性細(xì)胞因子生成的變化。研究取得了如下結(jié)果： 1.成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pPUR/U6-

6、siJABl 選擇小鼠JABl基因(AF065386)，根據(jù)siRNA序列選擇的一般原則，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)信息，選定RNAi作用的靶序列。以靶序列為基礎(chǔ)，設(shè)計并合成能在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄形成shRNA的寡核苷酸序列，并在兩端引入ApaI和EcoRI酶切位點，寡核苷酸退火形成雙鏈后與ApaI和EcoRI酶切的線性化質(zhì)粒pPUR/U6定向連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。篩選后挑取陽性克隆，抽提的質(zhì)粒經(jīng)過酶切和測序鑒定，最終得到正確的重組質(zhì)粒pPUR/U

7、6-siJABl。 2.低表達(dá)JABl細(xì)胞克隆的篩選鑒定 通過鏡下直接觀察和MTT法分析不同濃度嘌呤霉素對正常RAW264.7細(xì)胞的影響，最終確定用于轉(zhuǎn)染后篩選的嘌呤霉素濃度為4ug/ml。轉(zhuǎn)染試劑采用脂質(zhì)體DOTAP，按常規(guī)方法操作，分別轉(zhuǎn)染pPUR/U6質(zhì)粒和pPUR/U6-siJABl質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后24h開始加入嘌呤霉素對細(xì)胞進行篩選。約4周后得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆，在維持嘌呤霉素篩選濃度不變的情況下逐步擴大培養(yǎng)，得

8、到足量的細(xì)胞用于后續(xù)實驗。收集各組細(xì)胞，提取總蛋白，用Westernblot檢測各組細(xì)胞的JABl表達(dá)情況，結(jié)果顯示：對照組與正常組相比，JABl的表達(dá)差異并不顯著，而干擾組的JABl表達(dá)明顯低于對照組與正常組，其JABl表達(dá)量為正常組的29％，說明構(gòu)建的JABl基因干擾質(zhì)粒在RAW264.7細(xì)胞中能夠有效的抑制JABl基因的表達(dá)，使JABl蛋白的表達(dá)量顯著下降，達(dá)到了預(yù)期的效果。 3.JABl低表達(dá)細(xì)胞在LPS刺激下生長速度和

9、炎性因子的濃度變化 用細(xì)胞計數(shù)的方法觀察JABl低表達(dá)細(xì)胞和正常細(xì)胞的生長情況，我們發(fā)現(xiàn)：在常規(guī)培養(yǎng)條件下，細(xì)胞的生長速度沒有明顯變化，細(xì)胞接種后約24h開始進入對數(shù)生長期；使用LPS刺激細(xì)胞后，在實驗中的24h、48h和72h三個時相點均觀察到JABl低表達(dá)細(xì)胞的數(shù)量明顯高于正常細(xì)胞數(shù)量，JABl低表達(dá)細(xì)胞在24h后開始進入對數(shù)生長期，而正常細(xì)胞在此時的生長仍然受到明顯的抑制，在48h后才進入對數(shù)生長期。說明JABl低表達(dá)細(xì)胞

10、對LPS刺激的耐受性較正常細(xì)胞高。 ELISA檢測LPS刺激后不同細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎性因子TNF-α和IL-6的濃度，我們發(fā)現(xiàn)：在實驗中的各個時相點，均觀察到JABl低表達(dá)細(xì)胞的培養(yǎng)上清中炎性因子濃度比正常細(xì)胞低。在TNF-α的檢測結(jié)果中，兩組細(xì)胞在6h、12h、24h、48h和72h時表現(xiàn)出了顯著的差異；而在IL-6的檢測結(jié)果中，JABl低表達(dá)細(xì)胞在6h時幾乎檢測不到培養(yǎng)上清中的IL-6，而在12h、24h、48h和72h時表現(xiàn)

11、出與正常細(xì)胞非常顯著的差異。說明JABl低表達(dá)細(xì)胞在LPS刺激后產(chǎn)生的炎性因子TNF-α和IL-6比正常細(xì)胞顯著降低。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建了針對小鼠JABl基因的RNAi表達(dá)載體，并在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7中使JABl蛋白表達(dá)量下調(diào)，其干擾效率為71％，為后續(xù)實驗提供了低表達(dá)JABl的細(xì)胞平臺。 2.本實驗條件下，JABl低表達(dá)細(xì)胞與正常細(xì)胞相比，在常規(guī)培養(yǎng)條件下生長速度沒有明顯差異；但在經(jīng)過LPS刺

12、激后，在實驗中各個時相點的細(xì)胞數(shù)量均高于正常細(xì)胞，且正常細(xì)胞進入對數(shù)生長期的時間較JABl低表達(dá)細(xì)胞延后。說明JABl的低表達(dá)能提高細(xì)胞對LPS刺激的耐受性。 3.本實驗條件下，JABl低表達(dá)細(xì)胞與正常細(xì)胞相比，在經(jīng)過LPS刺激后產(chǎn)生的TNF-α和IL-6明顯降低。說明JABl的低表達(dá)能降低細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后產(chǎn)生的炎性因子TNF-α和IL-6濃度。 JABl是一種重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，在多種生物學(xué)效應(yīng)中起重要作用，它能夠分