Jab1基因靶向RNA干擾對喉癌生長抑制的實驗研究.pdf

1、喉鱗狀細胞癌(Laryngeal Squamous Cell Carcinoma,LSCC)和其它腫瘤一樣,是一種多基因性、多步驟、多階段的發(fā)生過程,發(fā)病機制復雜,治療困難。目前,喉癌治療以手術切除或放療為主,盡管取得了較大進展,但手術致殘率高、并發(fā)癥多,常規(guī)放療的毒副作用大,療效差,特別是晚期腫瘤病人,轉移率高,病人生存率低。因此,急需尋找有效、簡便的治療方法。隨著喉癌相關基因及分子生物學研究的發(fā)展,喉癌基因治療的相關研究也在不斷深入

2、。
　　 對腫瘤相關基因在轉錄、轉錄后和翻譯等水平特異性的阻斷能夠誘導腫瘤細胞向成熟方向轉化或凋亡。RNA干擾((RNA interference,RNAi)現(xiàn)象廣泛存在于各種生物體中,能夠在哺乳動物細胞內產生特異性的基因沉默,在后基因組研究中得到廣泛應用,是分子靶向抗癌治療的分子學基礎。最近,RNA干擾作為一種抗癌治療的方法已經進入實驗階段,預計將發(fā)展成為一種基因治療的藥物。
　　 Jab1(C-Jun activat

3、ion domain-binding protein1)位于COP9(COP9signalosome,CSN)信號復合體的第五亞單位,早期研究證明Jab1是c-Jun激活區(qū)的輔助激活因子,后來研究發(fā)現(xiàn) Jab1也是激活蛋白-1(activator protein1,AP-1)的輔助因子,最近研究證實Jab1和多種蛋白的出核轉運降解有關,例如p27kip1(kinase inhibit protein1,P27)、P53、Smad4。Ja

4、b1作為一個潛在的致癌基因在多種腫瘤疾病的發(fā)展中起著調節(jié)器的作用。
　　 P27是細胞周期素依賴的激酶抑制因子,通常在細胞核內發(fā)生作用,Jab1可以與P27發(fā)生作用并改變其細胞定位使其出核降解,從而導致腫瘤細胞無限增殖,Jab1與P27在各種腫瘤細胞的研究中表明存在負相關性。
　　 在我們前期的實驗中發(fā)現(xiàn)Jab1在人類喉癌細胞中高表達,與P27的表達存在負相關性,并利用RNAi技術沉默喉癌細胞中活躍的癌基因Jab1的表達

5、,通過RT-PCR、流式細胞學、MTT的方法檢測到其能達到阻止或減緩腫瘤細胞生長的目的。在本研究中,我們通過應用RNA干擾技術來研究Jab1的低表達對喉癌細胞的細胞株(Hep-2細胞)在體外增殖的影響,使用一系列的干擾方式,例如,短發(fā)夾施工干擾 RNA(shRNA)的質粒和非特異性質粒抑制Jab1的表達,通過WST-8檢測細胞增殖的能力,通過 Western Blotting檢測基因的表達。為了觀察shRNA質粒在體內引起Jab1的下調

6、對腫瘤生長的影響,我們將Hep-2腫瘤細胞在裸鼠皮下注射建立人喉癌異種移植瘤模型。模型建立后經與Jab1shRNA質粒和對照組治療,腫瘤的生長受到了抑制。這些結果為人類喉癌治療提供了新的實驗數(shù)據(jù)。
　　 本實驗共分為兩個部分:
　　 第一部分 Jab1靶向shRNA質粒的構建及其對喉癌細胞Hep-2目的基因沉默效應的研究
　　 目的:利用RNA干擾技術,構建Jab1基因靶向shRNA質粒,觀察目的基因的沉默效應及

7、對Hep-2腫瘤細胞的影響。
　　 方法：設計合成以Jab1基因為靶向目標的shRNA,將其定向克隆到真核表達載體pGenesill.1中形成重組質粒；利用脂質體介導的方法將質粒轉染至人喉癌細胞株(Hep-2),通過WST-8、Western Blotting的方法對細胞凋亡及蛋白水平的表達變化進行檢測,分析shRNA干擾質粒對喉癌細胞的影響。
　　 結果：成功構建了Jab1基因靶向的pJab1以及陰性對照pKB真核重組

8、質粒。WST-8結果示pJab1重組質粒能顯著抑制Hep-2細胞的增殖活性,與對照組相比,顯著差異(p<0.001)。Western Blotting結果示Hep-2-pJab1細胞Jab1蛋白表達量明顯降低,P27蛋白表達量明顯升高,與對照組相比,差異顯著(p<0.001)。
　　 結論：構建靶向Jab1癌基因的shRNA干擾質粒能夠下調Jab1基因的表達,上調p27基因的表達,抑制人喉癌細胞株Hep-2細胞在體外的增殖。

9、r>　　 第二部分Jab1基因沉默對裸鼠人喉癌移植瘤生長影響的實驗研究
　　 目的:探討Jab1重組質粒對人喉癌Hep-2細胞裸鼠移植瘤生長的影響。
　　 方法：建立了喉癌Hep-2細胞裸鼠皮下移植瘤模型,通過瘤體內注射pJab1,pKB,PBS,觀察瘤體增長情況,通過免疫組化方法、RT-PCR、Western Blotting等觀察瘤體內Jab1、P27的mRNA水平及蛋白水平的變化。
　　 結果：成功建立喉

10、癌Hep-2細胞裸鼠皮下移植瘤模型；pJab1質粒組的腫瘤體積為(267.60±88.19)mm3,瘤重為(0.49±0.03)g,顯著低于錯意序列對照組和空白對照組；免疫組化結果顯示實驗組瘤內的Jab1蛋白的表達水平降低,顯著低于對照組,P27蛋白的表達水平增高,顯著高于對照組；RT-PCR結果顯示實驗組瘤內Jab1的mRNA水平顯著降低,P27的mRNA無明顯變化；WesternBlotting結果顯示實驗組瘤內Jab1蛋白表達量明