RNA干擾技術沉默Gab1基因抑制血管生成的體外實驗研究.pdf

1、目的：
　　探討應用RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術沉默Gab1基因使其在體外抑制血管生成的研究,為進一步進行抑制腫瘤血管生成和其他血管性疾病的實驗研究奠定基礎,為腫瘤和其他血管性疾病的基因治療提供實驗依據。
　　方法：
　　1、采用含10％胎牛血清的DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)作為培養(yǎng)基,獲取3—7代EA.hy926細胞。
　　2、以G

2、ab1的mRNA已知序列為靶點,構建LV-Gab1-siRNA慢病毒載體,轉染EA.hy926細胞,獲取Gab1基因特異的siRNA干擾EA.hy926細胞。
　　3、在24孔培養(yǎng)板上,將配好的基質膠工作液以200~250ul/cm2的量加入孔中,建立體外血管生成的三維培養(yǎng)模型。取P4代EA.hy926細胞隨機分成3組(n=8):空白對照組為正常EA.hy926細胞接種組(n=8),EA.hy926細胞直接接種到含三維培養(yǎng)模型的孔

3、板中;陰性對照組為無關序列(LV-scr-siRNA)轉染組(n=8),操作與空白對照組相同,但是細胞經過基因Scr特異的siRNA慢病毒載體轉染;干擾組為Gab1基因特異的siRNA干擾組(n=8),操作與空白對照組相似,但細胞經過慢病毒介導Gab1基因特異的siRNA干擾。
　　4、將24孔培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中,24h后鏡下觀察血管樣結構情況(數目、長度)。
　　5、以上3組中的一部分EA.hy926細胞用于逆轉錄-聚合酶

4、連反應(Real-timePCR)和westernblotting實驗,檢測Gab1的mRNA和蛋白質表達水平;采用Tanswell小室遷移實驗檢測3組細胞的遷移能力;用流式細胞儀檢測細胞凋亡。
　　結果：
　　1、EA.hy926細胞慢病毒轉染3d后,在熒光倒置顯微鏡下觀察到明顯的綠色熒光。
　　2、慢病毒干擾組細胞形態(tài)變化明顯,由長梭形逐漸變成星形或多角形,而陰性和空白對照組細胞變化不明顯,呈梭形。
　　3、

5、RT-PCR檢測結果顯示:慢病毒干擾組Gab1基因mRNA的表達水平明顯受抑制(P<0.05),而空白和陰性對照組之間均無明顯差異(P>0.05)。
　　4、Westernblot檢測證實慢病毒干擾組未見陽性條帶,而陰性和空白對照組在110KDr均出現特異行條帶。
　　5、小室遷移實驗顯示:干擾組遷移細胞數量較空白組和陰性對照組明顯減少(P<0.05),而空白組和陰性對照組遷移的細胞數相近(P>0.05)。
　　6、流

6、式細胞儀檢測三組細胞凋亡顯示:干擾組細胞凋亡比例較空白組和陰性對照組細胞均明顯高(P<0.05),而空白組和陰性對照組之間沒有明顯區(qū)別(P>0.05)。
　　7、LV-Gab1-siRNA轉染后的EA.hy926細胞在體外三維培養(yǎng)模型中血管樣結構形成的數量和長度均明顯減少(P<0.05),表明血管生成受到明顯抑制。
　　結論：
　　Gab1-siRNA能夠抑制EA.hy926細胞中Gab1基因的mRNA及其蛋白的表達,