去甲苔蘚蒽噻吩抑制血管生成作用的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景與目的：
　　 1971年，哈佛大學(xué)Folkman 教授提出“實(shí)體瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管生成”觀點(diǎn)以來，大量后期實(shí)驗(yàn)研究已從分子和基因水平充分證實(shí)了這一觀點(diǎn)。血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和分化是新生血管形成過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此,抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移,以及誘導(dǎo)其凋亡是抗血管生成有效的靶點(diǎn)。目前抗血管生成療法已經(jīng)成為治療腫瘤的新策略。2002年，Jeong等從海洋苔蘚蟲Watersipora subtorquat

2、a中分離得到噻吩環(huán)系結(jié)構(gòu)的苔蘚蒽噻吩(bryoanthrathiophene），證實(shí)其具有明顯抑制BAEC 體外增殖及血管生成的作用。使苔蘚蒽噻吩類化合物可望成為具有全新結(jié)構(gòu)的抗腫瘤藥物。為研究理化性質(zhì)和構(gòu)效關(guān)系，第三軍醫(yī)大學(xué)藥物化學(xué)教研室周向東教授等以1,8-二羥基-9,10-蒽醌為原料創(chuàng)新性地設(shè)計(jì)合成了苔蘚蒽噻吩類似物—DBT。但其是否具有抑制血管生成活性的研究還未進(jìn)行。鑒于DBT的合成經(jīng)濟(jì)、高效并具有產(chǎn)業(yè)化前景，本研究旨在通過一系

3、列體外實(shí)驗(yàn)探討DBT對(duì)HUVECs、A549 體外增殖的影響，以及對(duì)HUVECs 血管生成的作用。
　　 方法：
　　 1．應(yīng)用MTT 法觀察不同濃度DBT 處理的HUVECs、A549在24h，48h，72h 體外增殖的影響。
　　 2．應(yīng)用平板劃痕法觀察不同濃度DBT 處理12h，24h后HUVECs 遷移的影響。
　　 3．應(yīng)用管腔形成實(shí)驗(yàn)觀察不同濃度DBT 處理24h后HUVECs 血管形成的影響

4、。
　　 4．應(yīng)用Annexin V-PI 雙染色法，流式細(xì)胞儀分析不同濃度DBT 處理48 h后HUVECs生長(zhǎng)周期及凋亡的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1．DBT對(duì)HUVECs 體外增殖的影響：MTT 結(jié)果顯示在0.16μM～0.48μM 范圍內(nèi)，加入DBT 24h后，HUVECs的體外增殖受到明顯抑制，并且隨著DBT濃度的增高，作用時(shí)間延長(zhǎng)，其抑制作用明顯增強(qiáng)，呈明顯的時(shí)間、劑量依賴性。72h IC50為0.

5、15 μM。DBT對(duì)A549細(xì)胞體外增殖的影響：MTT 結(jié)果顯示低濃度DBT (0.16 μM）在作用24h，48h，抑制效果不明顯，甚至輕微促進(jìn)人肺腺癌細(xì)胞A549 生長(zhǎng)，但作用72h能明顯抑制A549細(xì)胞體外增殖。較高濃度的DBT在作用24 h后即可明顯抑制其體外增殖。24h IC50為0.36 μM，48h IC50為0.33 μM，72h IC50為0.15 μM，呈明顯時(shí)間、劑量依賴性。
　　 2．不同濃度DBT 處理

6、12，24h后HUVECs 遷移的影響：平板劃痕法結(jié)果顯示0.32μmol/L DBT作用HUVECs 12h 相對(duì)于對(duì)照組抑制率約為37.93％；當(dāng)濃度達(dá)到0.48 μM時(shí)，作用12h后相比于對(duì)照組劃痕間距更加明顯，抑制率達(dá)到79.07％(P<0.01)。
　　 3．不同濃度 DBT作用24h后，與空白組相比，0.04 μM、0.20μM、0.40μM 實(shí)驗(yàn)組及含有0.02 μM endostar的陽(yáng)性對(duì)照組HUVECs構(gòu)建形

7、成的管腔樣網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)明顯減少。
　　 與空白對(duì)照組比較，Endostar組管腔形成抑制率達(dá)到92.66％(P<0.01）；0.04 μM對(duì)HUVECs 管腔形成抑制率為56.66％(P<0.01）；當(dāng)DBT濃度為0.20μM時(shí)，管腔形成抑制率達(dá)到82.46％(P<0.01）；在0.40μM時(shí)，抑制率達(dá)97.23％(P<0.01）。
　　 4．用流式細(xì)胞儀分析不同濃度DBT 處理HUVECs 48h后的細(xì)胞周期變化情況，發(fā)現(xiàn)

8、隨著DBT的作用濃度提高,G0/G1期細(xì)胞比例明顯上升,細(xì)胞較多的阻滯于該期，而S 期、G2/M 期細(xì)胞所占比例逐漸下降,HUVECs細(xì)胞的增殖受到抑制。不同濃度的DBT 處理HUVECs細(xì)胞48h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡顯示，HUVECs的凋亡率隨著DBT濃度的增加而升高，細(xì)胞的凋亡比例分別從5.9％上升至27.46％，45.58％，59.54％。
　　 結(jié)論：
　　 1．MTT 法分析發(fā)現(xiàn)，DBT能明顯抑制HUVE

9、Cs、的體外增殖，HUVECs在DBT作用72h的IC50為0.15 μM，A549細(xì)胞分別在DBT 24h，48h，72h的IC50為0.36 μM、0.33 μM、0.30μM，對(duì)HUVECs、A549細(xì)胞體外增殖的抑制作用呈劑量和時(shí)間依賴性。
　　 2．平板劃痕法觀察不同濃度DBT 處理12，24h后HUVECs 遷移發(fā)現(xiàn)隨著DBT濃度的升高，作用時(shí)間延長(zhǎng)，相對(duì)于對(duì)照組劃痕間距越發(fā)明顯。提示DBT在血管生成過程中的內(nèi)皮細(xì)胞

10、遷移階段也起著明顯抑制作用。
　　 3．體外管腔形成實(shí)驗(yàn)研究了DBT對(duì)HUVECs 官腔形成的影響。同時(shí)采用目前公認(rèn)的抗血管生成抑制劑Endostar作為陽(yáng)性對(duì)照，發(fā)現(xiàn)低濃度的DBT 0.04 μM，作用24h，HUVECs構(gòu)建形成的管腔樣網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)明顯減少，當(dāng)DBT濃度達(dá)到0.40μM，發(fā)現(xiàn)與Endostar 0.02 μM對(duì)小管形成影響效果相近，Endostar在0.02 μM對(duì)體外管腔形成抑制作用最為明顯。4．通過流式細(xì)胞儀