白藜蘆醇抑制關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞去分化的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的
　　研究白藜蘆醇對體外單層培養(yǎng)條件下兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞去分化的影響，并探討白藜蘆醇(Resveratrol，Resv)抑制體外單層培養(yǎng)條件下兔軟骨細(xì)胞去分化的調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　方法
　　利用胰蛋白酶聯(lián)合II型膠原酶序貫消化法分離培養(yǎng)正常兔髖關(guān)節(jié)原代軟骨細(xì)胞，并行Alcian Blue細(xì)胞染色鑒定；實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分五組：空白對照組，0μM Resv組，2.5μM Resv組，5μM Resv組，10μM Resv組，分別于第1

2、、3、5、代細(xì)胞融合達(dá)80％以上時(shí)提取RNA及蛋白；CCK-8法檢測各組每代軟骨細(xì)胞的在450nm的吸光度，并繪制生長曲線；β-半乳糖苷酶（ senescence-associatedβ-galactosidase，SA-β-gal）染色對去分化的衰老細(xì)胞進(jìn)行染色；倒置相差顯微鏡下每日觀察細(xì)胞形態(tài)，RT-PCR檢測蛋白多糖Aggrecan，Sirt-1，p53，p21以及P16基因的表達(dá)水平；western blot檢測Aggrecan

3、，Sirt-1，p53，p21以及P16蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果
　　結(jié)合Alcian Blue染色及形態(tài)學(xué)觀察提示所培養(yǎng)細(xì)胞為兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞；形態(tài)學(xué)觀察及 SA-β-gal、Alcian Blue染色顯示在體外連續(xù)單層培養(yǎng)條件下，軟骨細(xì)胞易發(fā)生去分化，而一定濃度范圍的白藜蘆醇可以抑制軟骨細(xì)胞去分化，且隨著傳代次數(shù)增加趨勢愈明顯，Alcian Blue染色提示低濃度Resv（2.5μM）組較其他組聚蛋白多糖表達(dá)水平高；β-半

4、乳糖苷酶染色顯示2.5μmol/LResv組藍(lán)染的衰老細(xì)胞數(shù)明顯減少；RT-PCR及western blot檢測顯示Resv能夠顯著上調(diào)Sirt1基因及蛋白表達(dá)水平，并下調(diào)P53，P21及P16基因的表達(dá)水平，抑制細(xì)胞去分化，且不影響細(xì)胞增殖。
　　結(jié)論
　　體外單層連續(xù)培養(yǎng)兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞易出現(xiàn)去分化現(xiàn)象，而這一現(xiàn)象與細(xì)胞衰老相關(guān)，白藜蘆醇可以抑制這種現(xiàn)象，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成，抑制軟骨細(xì)胞的去分化，這一機(jī)制與Sirt1的上