嬰幼兒關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)和表型研究及逆向誘導(dǎo)分化初探.pdf

1、一、嬰幼兒關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)及其鑒定
　　目的:探索體外培養(yǎng)嬰幼兒關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的方法，并對(duì)其細(xì)胞表型進(jìn)行鑒定，為下一步逆向誘導(dǎo)分化提供細(xì)胞。
　　方法:取多指患兒指間關(guān)節(jié)的軟骨，經(jīng)過(guò)機(jī)械剪切、胰酶、膠原酶的消化獲得細(xì)胞后，用1640培養(yǎng)基進(jìn)行體外培養(yǎng)。
　　倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)情況，繪制關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)； Alcian blue染色、蕃紅花“O”-亮綠染色檢驗(yàn)細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白

2、聚糖；阿利新蘭法檢測(cè)不同代次細(xì)胞蛋白聚糖含量；免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)細(xì)胞分泌的II型膠原。
　　結(jié)果:嬰幼兒關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。原代細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，細(xì)胞10~15天長(zhǎng)滿六孔培養(yǎng)板的一孔，進(jìn)行傳代；第1代、2代、3代等細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，3~5天長(zhǎng)滿40ml培養(yǎng)瓶的一瓶；細(xì)胞在第12代、13代出現(xiàn)凋亡表現(xiàn)。
　　關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線呈倒“S”型，透射電子顯微鏡觀察到細(xì)胞具有軟骨細(xì)胞共性。Alcian blue染色陽(yáng)性，蕃紅花“O”-

3、亮綠染色陽(yáng)性；第1、2、3代關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞蛋白聚糖含量逐漸增高，第5、6代后細(xì)胞蛋白聚糖含量逐漸減低；免疫組織化學(xué)染色證實(shí)細(xì)胞分泌II型膠原。
　　結(jié)論:在體外成功建立了嬰幼兒關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)方法，經(jīng)多種鑒定證實(shí)所培養(yǎng)出的細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞。
　　二、嬰幼兒關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞采用iPS技術(shù)逆向誘導(dǎo)分化的初步研究
　　目的:嘗試采用iPS技術(shù)誘導(dǎo)嬰幼兒關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞逆向分化為多能分化狀態(tài)。
　　方法:先培養(yǎng)胎鼠肌細(xì)胞并用絲