兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定.pdf

1、目的：優(yōu)化兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分離方法，探索其體外單層培養(yǎng)過程條件及端粒、生物學(xué)功能學(xué)特性的變化。
　　 方法：選用4周齡雄性、健康、新西蘭大白兔的關(guān)節(jié)軟骨，采用機(jī)械、雙酶消化法進(jìn)行分離得到關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞。測(cè)定細(xì)胞存活率，并在含有10％胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中進(jìn)行體外單層培養(yǎng)。待細(xì)胞融合率達(dá)到85%至90%時(shí)，用胰蛋白酶消化收集并以相同密度鋪板傳代。逐代觀察細(xì)胞形態(tài)及應(yīng)用MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線：同時(shí)采用甲苯胺藍(lán)染色和RT-PCR

2、方法動(dòng)態(tài)研究各代關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的蛋白多糖，Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白與端粒酶因水平的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：本方法兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞收集過程簡(jiǎn)便、高效，平均每克軟骨可得到2×106個(gè)細(xì)胞。在體外單層培養(yǎng)的過程中，隨傳代次數(shù)增加，軟骨細(xì)胞傳代時(shí)間變長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)逐漸向“纖維樣”細(xì)胞轉(zhuǎn)化。Ⅰ型膠原蛋白基因水平的表達(dá)呈遞增趨勢(shì)，Ⅱ型膠原蛋白與端?；蛩降谋磉_(dá)呈遞增趨勢(shì)，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白多糖逐漸減少。前三代細(xì)胞具有較高的生物學(xué)及功能學(xué)特性表達(dá)，四代后主要