應(yīng)用旋壁生物反應(yīng)器體外培養(yǎng)兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞.pdf

1、關(guān)節(jié)軟骨損傷、缺損所導(dǎo)致的剝脫性骨軟骨炎、骨性關(guān)節(jié)炎這些疾病，一直缺乏有效的治療手段。主要原因是因?yàn)槿梭w關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，難以完成自身修復(fù)。 近年來(lái)，隨著組織工程(Tissue Engineemg)技術(shù)的介入，對(duì)該病的治療有了新的突破。自體軟骨細(xì)胞移植(Autologous Chondrocyte Implantation，ACI)成為目前治療關(guān)節(jié)軟骨缺損疾病的最佳途徑。 ACI通過(guò)體外培養(yǎng)、擴(kuò)增患者自體軟骨細(xì)胞，

2、然后移植到病損處，修復(fù)軟骨缺損。傳統(tǒng)單層培養(yǎng)(monolaver)方法可以進(jìn)行軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)和擴(kuò)增，但這種方法細(xì)胞擴(kuò)增速度有限，且軟骨細(xì)胞容易失去其分化表型。因此在體外培養(yǎng)時(shí)如何快速獲得大量有良好分化表型的軟骨細(xì)胞，是ACI修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨的關(guān)鍵問(wèn)題。 復(fù)習(xí)文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn)，旋壁生物反應(yīng)器(Rotating W_all VesselBioreactor，RWVB)對(duì)多種細(xì)胞及組織的體外培養(yǎng)，包括軟骨細(xì)胞，都有優(yōu)于傳統(tǒng)單層培養(yǎng)的效果。于是

3、，進(jìn)行了使用RWVB作關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的嘗試。 本研究使用生物反應(yīng)器(Bioreactor)進(jìn)行兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)，利用細(xì)胞培養(yǎng)、免疫組織化學(xué)等技術(shù)，觀察細(xì)胞存活率、生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞代謝和組織形態(tài)學(xué)的改變，并與單層培養(yǎng)作以比較，探討更加合理的細(xì)胞體外培養(yǎng)方式。 目的 選用旋壁生物反應(yīng)器對(duì)兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，并與傳統(tǒng)單層培養(yǎng)方法作以比較。為改進(jìn)軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)方法提供依據(jù)。 方法

4、1 無(wú)菌條件下切取3周齡兔關(guān)節(jié)表面軟骨組織，酶消化法分離提取，獲得原代(第O代)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞。 2 方瓶培養(yǎng)并傳代。收集第l代軟骨細(xì)胞分為兩組，A組使用24孔板單層培養(yǎng)；B組使用旋壁生物反應(yīng)器三維培養(yǎng)。 3 用倒置相差顯微鏡、細(xì)胞染色等方法對(duì)兩組細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程進(jìn)行觀察、監(jiān)測(cè)、鑒定，比較兩種培養(yǎng)方法對(duì)細(xì)胞活力、增殖速度、Ⅱ型膠原產(chǎn)量的影響。在培養(yǎng)開始后每天分別對(duì)兩組細(xì)胞取樣，MTT法繪制生長(zhǎng)曲線，計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間，作數(shù)據(jù)

5、分析。 結(jié)果 1 形態(tài)學(xué)觀察顯示：兩組兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)后24h開始貼壁。A組細(xì)胞外形為圓形或三角形，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞體積變大，向梭形發(fā)展。B組軟骨細(xì)胞外形始終保持圓形或橢圓形，細(xì)胞呈團(tuán)簇聚集生長(zhǎng)。 2 生長(zhǎng)曲線表明，兩組細(xì)胞均在培養(yǎng)48h左右進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，A組細(xì)胞相對(duì)B組細(xì)胞增長(zhǎng)緩慢。B組細(xì)胞的平均倍增時(shí)間顯著短于A組細(xì)胞，檢測(cè)數(shù)據(jù)分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 3 甲苯胺藍(lán)染色及免疫組化染色提示