細(xì)胞骨架破壞對(duì)體外培養(yǎng)兔軟骨細(xì)胞基質(zhì)代謝分泌的影響.pdf

1、研究背景：隨著老齡化進(jìn)程加快和體育運(yùn)動(dòng)普及，骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthrit is，OA）、關(guān)節(jié)軟骨損傷等軟骨細(xì)胞相關(guān)疾病逐年增加。有大量的研究表明細(xì)胞骨架（cytoskeleton，CSK）在軟骨退變及OA 發(fā)生的過(guò)程有著明顯改變。本課題目的就在于探討細(xì)胞骨架的三種成分在軟骨細(xì)胞基質(zhì)代謝中的作用，進(jìn)而揭示骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞退變發(fā)病機(jī)理。同時(shí)可以應(yīng)用某些調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架成分降解的手段來(lái)干預(yù)骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生、發(fā)展的負(fù)面作用，為骨性關(guān)節(jié)炎的治

2、療開(kāi)辟新的途徑。
　　 目的：利用激光掃描共聚焦顯微鏡（laser confocAlscanning microscope，LCSM）觀察軟骨細(xì)胞CSK 形態(tài)，并對(duì)軟骨細(xì)胞CSK蛋白熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量測(cè)定，觀察正常與加入三種細(xì)胞骨架破壞劑的軟骨細(xì)胞CSK 形態(tài)及蛋白量以確定CSK 破壞是否有效。在明確了細(xì)胞骨架微絲、微管和中間纖維三種成分被相應(yīng)的細(xì)胞骨架破壞劑破壞以后分析微絲、微管和中間纖維三種細(xì)胞骨架（cytoskeleton，

3、CSK）成分破壞對(duì)體外培養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞基質(zhì)代謝（Ⅱ型膠原和糖胺多糖）的影響。
　　 方法：取2月齡新西蘭大白兔10只，取雙膝關(guān)節(jié)軟骨行軟骨細(xì)胞培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，隨機(jī)分為四組，即正常對(duì)照組、微絲破壞組（加入0.01mg/L細(xì)胞松弛素-D 破壞肌動(dòng)蛋白）、微管破壞組（加入0.4mg/L 秋水仙素破壞微管蛋白）、中間纖維破壞組（加入175mg/L丙烯酰胺破壞波形蛋白）。培養(yǎng)3天后，各組取部分細(xì)胞消化并爬片，行免疫熒光染色及共聚焦顯微

4、鏡熒光值半定量檢測(cè)。觀察各組細(xì)胞微絲蛋白、微管蛋白和波形蛋白的形態(tài)及含量變化。并于培養(yǎng)第3、6、9天取各組細(xì)胞上清液，用ELISA 法和阿爾新藍(lán)法檢測(cè)各組上清液中Ⅱ型膠原和糖胺多糖（proteoglycan，GAG）的含量。
　　 結(jié)果：軟骨細(xì)胞微絲呈絲狀，分布在細(xì)胞質(zhì)膜的內(nèi)側(cè)，沿細(xì)胞外圍輪廓排列，微絲破壞后可見(jiàn)微絲細(xì)胞外圍的增亮固體環(huán)減弱。微管在核周呈放射狀散向整個(gè)細(xì)胞，微管破壞組可見(jiàn)微管解聚，蛋白結(jié)構(gòu)稀疏。波形蛋白呈細(xì)絲狀，

5、形成相互交織的貫穿胞質(zhì)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，中間纖維破壞組可見(jiàn)細(xì)胞變圓，蛋白熒光減低。對(duì)三種骨架蛋白成分的平均熒光值進(jìn)行相應(yīng)的分析，可見(jiàn)相應(yīng)CSK 破壞組熒光值與對(duì)照組相比均明顯降低（p<0.05）。同時(shí)，微管破壞組和中間纖維破壞組在第3、6、9天上清液中的Ⅱ型膠原和GAG 含量均明顯低于對(duì)照組（p<0.05），而微絲破壞組與對(duì)照組在第3、6、9天上清液中的Ⅱ型膠原和GAG含量均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)論：預(yù)設(shè)濃度的CSK 破壞劑可以破壞