地塞米松對體外培養(yǎng)人眼小梁細(xì)胞連接蛋白表達(dá)和細(xì)胞骨架的影響研究.pdf

1、目的 本研究通過體外培養(yǎng)人眼小梁細(xì)胞，將地塞米松作為激素性處理因素，分子生物學(xué)方法檢測體外培養(yǎng)的人眼小梁細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1和間隙連接蛋白Cx43表達(dá)的變化及Actin骨架形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。旨在從新的角度解釋房水流出阻力的調(diào)節(jié)機(jī)制，為GIG和POAG的發(fā)病機(jī)理的研究提供新的思路，為探討其治療措施提供新的方向。 方法 1.人眼小梁細(xì)胞的體外培養(yǎng)和鑒定：用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)正常人小梁細(xì)胞(NTM)及POAG患者小梁細(xì)

2、胞(GTM)，傳代培養(yǎng)永生化小梁細(xì)胞株(iHTM，加拿大Vincent Raymond教授惠贈)，顯微鏡觀察、免疫細(xì)胞化學(xué)等方法鑒定小梁細(xì)胞。 2.激素處理小梁細(xì)胞：將細(xì)胞分為對照組和處理組，處理組細(xì)胞培養(yǎng)液添加10mol/L地塞米松進(jìn)行培養(yǎng)觀察細(xì)胞連接蛋白表達(dá)的改變，處理組細(xì)胞培養(yǎng)液添加5<'*>10<'-7>mol/L地塞米松進(jìn)行培養(yǎng)觀察細(xì)胞骨架形態(tài)變化。 3.小梁細(xì)胞ZO-1、Cx43蛋白表達(dá)的檢測：應(yīng)用免疫熒光

3、細(xì)胞化學(xué)，RT-PCR、Westem blot方法分別從mRNA水平和蛋白水平檢測小梁細(xì)胞ZO-1、Cx43的表達(dá)。 4.小梁細(xì)胞骨架形態(tài)的檢測：應(yīng)用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測小梁細(xì)胞Actin骨架形態(tài)的改變。 結(jié)果 1.小梁細(xì)胞體外培養(yǎng)結(jié)果成功體外培養(yǎng)正常人眼、POAG患者及永生化小梁細(xì)胞，鏡下可見：POAG患者與正常人，地塞米松處理組與對照組小梁細(xì)胞形態(tài)、分布上未見明顯差別。 2.小梁細(xì)胞連接蛋白表達(dá)檢

4、測結(jié)果 1) 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示Dex處理2天后，人眼小梁細(xì)胞ZO-1、Cx43蛋白分布無明顯變化，均定位于相鄰細(xì)胞邊界； 2) RT-PCR結(jié)果顯示各組小梁細(xì)胞在mRNA水平均有ZO-1、Cx43的表達(dá)；其中ZO-1存在兩種亞型α+/α-，ZO-1α+比α-表達(dá)量少； 3) Westem blot結(jié)果顯示各組小梁細(xì)胞在蛋白水平均有ZO-1、Cx43表達(dá)。 對于正常人眼小梁細(xì)胞，只檢測到ZO-

5、1一種亞型α-和Cx43表達(dá)。Dex處理4天時(shí)間內(nèi)隨著時(shí)間的延長各組細(xì)胞兩種蛋白的表達(dá)均呈上升趨勢，相同時(shí)間點(diǎn)地塞米松處理組兩種蛋白的表達(dá)量明顯較對照組高；Dex處理5天后，隨著時(shí)間的延長各組細(xì)胞兩種蛋白的表達(dá)均呈下降趨勢，相同時(shí)間點(diǎn)地塞米松處理組兩種蛋白的表達(dá)量明顯較對照組低。 對于POAG患者小梁細(xì)胞，檢測到ZO-1兩種亞型α+/α-和Cx43表達(dá)。兩種蛋白隨著時(shí)間延長表達(dá)先呈上升趨勢， Dex處理6天左右，隨著時(shí)間的延長各

6、組細(xì)胞兩種蛋白的表達(dá)均呈下降趨勢；相同時(shí)間點(diǎn)地塞米松處理組ZO-1a+和Cx43蛋白的表達(dá)量明顯較對照組高。 3.小梁細(xì)胞骨架形態(tài)檢測結(jié)果 1) 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示正常人眼小梁細(xì)胞的DEX處理組可見CLANs結(jié)構(gòu)形成而對照組未見此結(jié)構(gòu)存在； 2) CLANs結(jié)構(gòu)可見于未加Dex處理的GTM和iHTM小梁細(xì)胞，而DEX處理組CLANs結(jié)構(gòu)形成明顯增多。 2.ZO-1α+在GTM的表達(dá)可能與POAG