體外沖擊波對(duì)體外培養(yǎng)兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖及相關(guān)生長(zhǎng)因子活性的影響.pdf

1、目的：
　　 關(guān)節(jié)軟骨缺損和損傷是骨關(guān)節(jié)外科常遇到的問(wèn)題，常由創(chuàng)傷和各種疾?。ㄈ绻切躁P(guān)節(jié)炎、骨軟骨炎、骨壞死等）引起。關(guān)節(jié)軟骨損傷后自身修復(fù)能力有限，大的關(guān)節(jié)軟骨缺損常由纖維軟骨而不是正常的透明軟骨修復(fù)。纖維軟骨在生物化學(xué)和組織結(jié)構(gòu)上與透明軟骨不同，常因無(wú)力承擔(dān)長(zhǎng)時(shí)間的關(guān)節(jié)內(nèi)各種機(jī)械應(yīng)力而退變。目前，關(guān)于促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)、提高修復(fù)質(zhì)量方面的研究頗多。但臨床上尚無(wú)一種方法能高質(zhì)量的修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷并達(dá)到很好的遠(yuǎn)期療效。

2、>　　 體外沖擊波療法（Extracorporeal Shock Wave Therapy，ESWT）作為骨科領(lǐng)域興起的新的非侵入性治療方法，在治療某些矯形外科和軟組織疾病方面較傳統(tǒng)外科方法存在許多優(yōu)勢(shì)。近年來(lái)，發(fā)現(xiàn)ESW在治療骨性關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）中有顯著療效，其作用機(jī)制未見相關(guān)分子生物學(xué)研究報(bào)道。
　　 本課題利用體外培養(yǎng)的正常原代軟骨細(xì)胞，施加不同能量強(qiáng)度的ESW刺激，探討ESW是否對(duì)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)

3、胞的增殖有影響，檢測(cè)ESW對(duì)軟骨細(xì)胞增殖情況的影響， ESW促進(jìn)軟骨修復(fù)作用的分子生物學(xué)機(jī)理、適合軟骨細(xì)胞增殖的能量范圍及ESW作為延緩OA發(fā)生發(fā)展的非侵入治療方法的可行性，為下步臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 選用健康的3月齡新西蘭兔20只，酶法消化正常兔膝關(guān)節(jié)軟骨獲得軟骨細(xì)胞。培養(yǎng)并傳3代，用臺(tái)盼藍(lán)染色法測(cè)細(xì)胞存活率。將傳3代的軟骨細(xì)胞隨機(jī)分為四組，A組：ESW能量0.5×105Pa，200次；B組：ES

4、W能量1.5×105Pa，200次；C組：ESW能量2.5×1 05Pa，200次；D組：空白對(duì)照組。干預(yù)后培養(yǎng)48小時(shí)，通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算細(xì)胞成活率，細(xì)胞爬片HE染色后倒置相差顯微鏡觀察形態(tài)，干預(yù)后各組軟骨細(xì)胞用臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞存活率，CCK-8法生長(zhǎng)曲線觀察增殖趨勢(shì)，ELISA檢測(cè)兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞bFGF、PCNA、CTGF、Collagen Ⅱ變化情況分析干預(yù)效果，了解ESW對(duì)兔膝軟骨細(xì)胞增殖活性的影響；用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法檢

5、測(cè)bFGF、CTGF、Collagerl Ⅱ mRNA的表達(dá)。記錄原始數(shù)據(jù)，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間均數(shù)比較采用兩樣本t檢驗(yàn)，運(yùn)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析以相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以p<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞增殖：臺(tái)盼藍(lán)染色后，死細(xì)胞染成淡藍(lán)色，而活細(xì)胞拒染，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)ESW干預(yù)后，B組細(xì)胞活性為（95±3）％，與A組、C組、空白對(duì)照相比差異有統(tǒng)

6、計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　 2、生長(zhǎng)曲線：ESW對(duì)正常兔膝軟骨細(xì)胞的影響顯著，最佳能量頻次200次和強(qiáng)度1.5×105Pa。ESW能量實(shí)驗(yàn)組A和實(shí)驗(yàn)組B在緩慢增長(zhǎng)期和指數(shù)增長(zhǎng)期均較實(shí)驗(yàn)組C和空白對(duì)照組有所增加（P<0.05）。但實(shí)驗(yàn)組B在第3日時(shí)間點(diǎn)與其他三組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。而且細(xì)胞增殖高峰提前，表明適當(dāng)能量的ESW可以明顯在時(shí)間和數(shù)量上促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖。
　　 3、細(xì)胞爬片HE染色，倒置相差顯

7、微鏡觀察：酶法消化獲得正常兔膝原代軟骨細(xì)胞。倒置相差顯微鏡觀察，剛分離的軟骨細(xì)胞形態(tài)呈輪廓清晰的圓形，核明亮而清楚，具折光性、旋光性。懸浮在培養(yǎng)液中，細(xì)胞大小略有差異。4h后大部分細(xì)胞開始貼壁，細(xì)胞也逐漸變得扁平透亮。24小時(shí)后軟骨細(xì)胞開始出現(xiàn)突起，細(xì)胞逐漸變成多邊形。3天后，軟骨細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞連片生長(zhǎng)，邊緣細(xì)胞突起較長(zhǎng)，細(xì)胞偏梭形，中央的細(xì)胞突起較短，呈多角形。7天軟骨細(xì)胞呈“鋪路石”樣改變。8天后細(xì)胞數(shù)量增多，胞漿內(nèi)容物增

8、加，部分細(xì)胞形成細(xì)胞團(tuán)塊或軟骨結(jié)節(jié)。
　　 4、ELISA檢測(cè) bFGF、PCNA、CTGF、Collagen Ⅱ顯示：各實(shí)驗(yàn)組bFGF、PCNA、CTGF、Collagetl Ⅱ表達(dá)均有增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。尤其是對(duì)bFGF作用更加明顯，實(shí)驗(yàn)組B（12.920±0.103）與空白對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組A能量組和實(shí)驗(yàn)組C相比有顯著性差異（P<0.01）。說(shuō)明ESW通過(guò)促進(jìn)對(duì)軟骨細(xì)胞有促增殖作用的生長(zhǎng)因子的表達(dá)，來(lái)起到促進(jìn)軟

9、骨細(xì)胞增殖的作用。
　　 5、RT-PCR法檢測(cè)bFGF、CTGF、Collagetl Ⅱ的表達(dá)：實(shí)驗(yàn)組B中，各種生長(zhǎng)因子的mRNA表達(dá)均較空白對(duì)照組增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中CTGF和Collagerl Ⅱ mRNA的表達(dá)實(shí)驗(yàn)組A和實(shí)驗(yàn)組B之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。此結(jié)果反應(yīng)出來(lái)的情況和ELISA法檢測(cè)結(jié)果一致。
　　 結(jié)論：
　　 1、ESW作為機(jī)械應(yīng)力在一定能量強(qiáng)度和頻次的情況下可顯

10、著促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖。從細(xì)胞水平證實(shí)軟骨細(xì)胞是對(duì)ESW應(yīng)力敏感細(xì)胞，具有能量依賴性，為下步實(shí)驗(yàn)應(yīng)用提供理論支持，為目前應(yīng)用ESW治療OA選用能量和次數(shù)參數(shù)提供參考范圍。
　　 2、本實(shí)驗(yàn)通過(guò)ESW適當(dāng)能量的干預(yù)，可以在較短時(shí)間內(nèi)培養(yǎng)出數(shù)量較大的軟骨細(xì)胞，為臨床實(shí)驗(yàn)及組織工程中種子細(xì)胞提供充足的、表型穩(wěn)定的細(xì)胞。
　　 3、ESW促進(jìn)軟骨細(xì)胞促增殖因子bFGF、CTGF表達(dá)，而這些生長(zhǎng)因子反過(guò)來(lái)發(fā)揮軟骨保護(hù)功能。進(jìn)而說(shuō)明ES