滾壓載荷生物反應(yīng)器促進(jìn)兔軟骨細(xì)胞-絲素蛋白多孔支架復(fù)合體生成功能化關(guān)節(jié)軟骨的研究.pdf

1、軟骨在人的日常生活中發(fā)揮著重要的作用，一旦軟骨受到破壞人的日常活動(dòng)會(huì)受到極大的影響。但軟骨組織缺乏充足的血供和淋巴循環(huán)，其修復(fù)和再生能力有限。由關(guān)節(jié)炎和創(chuàng)傷導(dǎo)致的骨關(guān)節(jié)軟骨損傷常常導(dǎo)致瘢痕愈合，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能的喪失，嚴(yán)重影響了人們的生活質(zhì)量。在眾多的治療修復(fù)手段中，運(yùn)用組織工程技術(shù)制造功能化的關(guān)節(jié)軟骨成為最具有應(yīng)用前景的方式。在工程化軟骨的生成過程中，生物材料及力學(xué)作用對(duì)生成的軟骨組織的結(jié)構(gòu)及功能有重要的影響。絲素蛋白是一種天然蛋白，

2、孔隙率高，對(duì)水及氧氣有良好的滲透性，生物相容性很好，其促血凝作用很低，細(xì)胞在其上的粘附增殖能力很強(qiáng)，可降解，具有良好的生物學(xué)彈性，在組織工程中得到大量的應(yīng)用。在正常的關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)中，關(guān)節(jié)軟骨受到了多種力學(xué)作用，包括直接壓縮力、靜水壓、流動(dòng)剪切力等。研究也發(fā)現(xiàn)力學(xué)作用可以改善組織工程支架的力學(xué)性能。許多生物生物反應(yīng)器被應(yīng)用于軟骨組織工程中。直接的動(dòng)態(tài)壓縮及流動(dòng)剪切力可以增加軟骨細(xì)胞支架的細(xì)胞增殖和基質(zhì)合成含量，力學(xué)性能也得到很大的改善。仿生滾

3、壓載荷生物反應(yīng)器最大程度的模擬生理狀態(tài)下軟骨組織的受力模式，對(duì)工程軟骨進(jìn)行直接壓縮及流動(dòng)剪切力作用。因此，本實(shí)驗(yàn)通過研究仿生力學(xué)的滾壓加載生物反應(yīng)器及絲素蛋白多孔支架的共同作用下對(duì)工程軟骨的生成影響。
　　 目的:觀察仿生力學(xué)加載對(duì)絲素蛋白多孔支架-軟骨細(xì)胞復(fù)合體生成工程軟骨的影響。
　　 方法:將2.5月齡新西蘭兔的軟骨組織在酶解法作用下分離出軟骨細(xì)胞，培養(yǎng)至第3代后將軟骨細(xì)胞接種于絲素蛋白多孔支架。將實(shí)驗(yàn)樣本分為力學(xué)

4、加載組和靜態(tài)培養(yǎng)組。在接種后24小時(shí)后，對(duì)力學(xué)加載組施加10％壓縮形變量0.33Hz2小時(shí)/天5天/周的仿生力學(xué)加載;靜態(tài)對(duì)照組的培養(yǎng)條件和滾壓加載組相同。分別在第3、7、14、21天時(shí)取各組樣品行細(xì)胞活性檢測，實(shí)時(shí)定量PCR，DAN、GAG和膠原含量檢測以及組織學(xué)染色，觀察細(xì)胞在滾壓加載及靜態(tài)培養(yǎng)支架上的存活、增殖、軟骨特異性基因及蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果:絲素蛋白具有良好的生物相容性。細(xì)胞活性染色表明力學(xué)加載組和靜態(tài)培養(yǎng)組絲

5、素-軟骨細(xì)胞支架中的死活細(xì)胞數(shù)目及細(xì)胞在支架中的存活率無差別。細(xì)胞接種后24小時(shí)，可見細(xì)胞均勻的分布于支架中，活細(xì)胞比大于96％。第7、14、21天時(shí)，力學(xué)加載組和靜態(tài)培養(yǎng)組的活細(xì)胞比例差別不大，力學(xué)加載組90.26％±2.3％，靜態(tài)培養(yǎng)組為89±1.2％。絲素蛋白-軟骨細(xì)胞復(fù)合體在靜態(tài)培養(yǎng)時(shí)，蛋白聚糖持續(xù)穩(wěn)定表達(dá);Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原的表達(dá)逐漸升高，分別在7天、14天時(shí)表達(dá)下調(diào)。絲素-軟骨細(xì)胞培養(yǎng)物靜態(tài)培養(yǎng)時(shí)，蛋白多糖及總膠原的表達(dá)也持

6、續(xù)增高。
　　 復(fù)合培養(yǎng)體在滾壓加載后細(xì)胞的軟骨特異性基因的表達(dá)較對(duì)照組明顯升高(P＜0.05)。在第7、14天時(shí)滾壓加載組的蛋白聚糖表達(dá)分別是靜態(tài)組的1.623倍（P=0.04）、3.298倍(P=0.002);但3、21天時(shí)，滾壓加載組蛋白聚糖是靜態(tài)組的0.72倍(P=0.26)、0.88倍(P=0.72)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。滾壓組的Ⅱ型膠原基因的表達(dá)也較靜態(tài)培養(yǎng)組高(P＜0.05)。在3、7、14、21天時(shí)，滾壓加載組的表達(dá)

7、量分別是靜態(tài)組的5.4倍(P＜0.01)、13.7倍(P＜0.01)、2.05倍（P=0.107）、4.51倍(P＜0.01)。Ⅰ型膠原在滾壓加載組出現(xiàn)短暫的表達(dá)上調(diào)，在第3天時(shí)，相對(duì)于靜態(tài)組升高了2.95倍(P＜0.01)。在7天、14天、21天時(shí)，滾壓加載的Ⅰ型膠原表達(dá)是對(duì)照組的0.70倍（P=0.34）、1.26倍(P=0.47)、1.38倍(P=0.09)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 滾壓加載組的蛋白多糖及總膠原的表達(dá)量高于

8、靜態(tài)培養(yǎng)組(P＜0.05)。第3、7、14、21天時(shí)滾壓加載組的蛋白多糖為12.17±1.835μg/(μgDAN),17.367±2.48μg(μgDAN),25.83±1.56μg/(μgDAN),30.25±3.41μg/(μgDAN)，分別是靜態(tài)組的分別是靜態(tài)組的1.71倍（P=0.01），1.66倍(P=0.06)，1.62倍(P＜0.01)，1.76倍（P＜0.01）。第3、7、21天滾壓組膠原是靜態(tài)組的1.23倍(P=0.

9、08)、0.73倍（P=0.17）、1.09倍(P=0.26)，但無明顯差異;在14天為1.52倍(P=0.045)，表達(dá)高于靜態(tài)組。但絲素-軟骨細(xì)胞復(fù)合體合成的大量蛋白多糖流失入培養(yǎng)基中，復(fù)合培養(yǎng)物中的含量較低;在21天時(shí)滾壓加載組支架中蛋白多糖保留率(10.5％)明顯低于靜態(tài)組(16.5％)(P＜0.05)，支架中蛋白多糖含量無差異。組織染色表明蛋白多糖均勻分布于復(fù)合培養(yǎng)體中，但滾壓組和靜態(tài)對(duì)照組的蛋白多糖無明顯差別，與生化檢測結(jié)果