滾壓載荷生物力學(xué)反應(yīng)器培養(yǎng)軟骨組織及Ⅱ型膠原對去分化軟骨的再分化作用.pdf

1、目的:研究滾壓載荷生物力學(xué)反應(yīng)器用于培養(yǎng)軟骨組織效果及Ⅱ型膠原對去分化軟骨的再分化作用。
　　 方法:
　　 1 自新西蘭大白兔雙膝關(guān)節(jié)提取軟骨細胞,經(jīng)體外培養(yǎng)瓶培養(yǎng)后,與瓊脂糖支架復(fù)合,應(yīng)用滾壓載荷生物力學(xué)反應(yīng)器周期性施加力學(xué)刺激,設(shè)置參數(shù)為壓縮形變量0.2,滾壓頻率1hz,滾壓時間0.5h/D。與滾壓7d、14d行死活細胞染色、Alcian Blue(AB)染色及GAG含量檢測,并于滾壓后14d取出樣本進行Ⅰ、Ⅱ型膠

2、原及蛋白聚糖mRNA表達的檢測。
　　 2 無菌條件下取7月齡新西蘭大耳白兔雙側(cè)膝關(guān)節(jié)分離培養(yǎng)軟骨細胞,體外單層傳代培養(yǎng)至第7代,分別為P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7。采用RT-PCR.、實時定量PCR、1,9二甲基亞甲藍(1,9-dimethylmethylenebluc,DMMB)法檢測其表型維持情況。根據(jù)觀察結(jié)果,選擇去分化的軟骨細胞(P7),并給予不同濃度(0.5％、1.0％、1.5％)Ⅱ型膠原蛋白刺激。采用R

3、T-PCR及實時定量PCR檢測各濃度組去分化軟骨細胞再分化的程度,DMMB法檢測糖胺聚糖分泌情況。
　　 結(jié)果:
　　 1 滾壓載荷生物力學(xué)反應(yīng)器培養(yǎng)軟骨組織研究結(jié)果:滾壓載荷后7d、14d,AB染色后可見對照組7d標(biāo)本未見明顯藍染團塊,14d可見小面積藍染團塊。實驗組7d可見切片部分區(qū)域少量蛋白聚糖分泌,14d大量蛋白聚糖分泌,使切片呈現(xiàn)團塊狀藍染。7d、14d實驗組GAG含量分別與對照組比較差異顯著(P＜0.05)。

4、于14d取實驗組及對照組標(biāo)本作Ⅰ、Ⅱ型膠原及蛋白聚糖mRNA的realtime RNA相對定量檢測。實驗組Ⅰ型膠原mRNA表達量明顯低于對照組(P＜0.05)。實驗組Ⅱ型膠原mRNA相對含量明顯高于對照組(P＜0.05)。實驗組糖胺聚糖mRNA相對含量明顯高于對照組(P＜0.05)。
　　 2 Ⅱ型膠原對去分化軟骨的再分化作用研究結(jié)果:P1～P7細胞糖胺聚糖含量分別為(12.20±0.17)、(11.20±0.24)、(11.1

5、8±0.16)、(10.89±0.50)、(8.73±0.19)、(9.39±0.32)、(8.18±0.20)μ g,P2、P3、P4間細胞糖胺聚糖含量比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);其余各代次細胞糖胺聚糖含量比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。P4、P5、P6、P7Ⅰ、Ⅱ型膠原及蛋白聚糖mRNA均有表達,其中P4～P7間Ⅰ型膠原mRNA表達比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);Ⅱ型膠原及蛋白聚糖比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)

6、意義(P＜0.05)。0.5％、1.0％、1.5％濃度組的P7軟骨細胞糖胺聚糖含量分別為(8.20±0.16)、(14.61±0.33)、(13.93±0.25)、(19.59±0.46)μg,組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。隨著Ⅱ型膠原蛋白濃度的升高,各濃度組細胞Ⅱ型膠原和蛋白聚糖mRNA表達逐漸增強,Ⅰ型膠原表達減弱;不同濃度組中Ⅰ、Ⅱ型膠原及蛋白聚糖mRNA表達比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。