MSCs與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)復(fù)合Ⅱ型膠原支架修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的實驗研究.pdf

1、目的 關(guān)節(jié)軟骨損傷是骨科臨床的常見疾病。成熟關(guān)節(jié)軟骨的自身修復(fù)能力較差，除與軟骨內(nèi)無血管、缺乏未分化的軟骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞被固定在一個致密的由膠原和蛋白多糖組成的固體基質(zhì)中有關(guān)外，可能還與以下兩個因素有關(guān)：①內(nèi)在修復(fù)依賴于軟骨細(xì)胞有絲分裂及短期內(nèi)增加的代謝產(chǎn)物(主要是膠原和蛋白多糖)，而成熟軟骨細(xì)胞有絲分裂能力極低：②外部愈合依賴于來自軟骨下骨的間充質(zhì)成分的參與，形成新的結(jié)締組織，經(jīng)過一系列變化形成纖維軟骨。20世紀(jì)80年代以來，

2、組織工程技術(shù)的迅速發(fā)展，為這一難題的解決提供了前所未有的機遇。人們利用軟骨組織工程技術(shù)，將細(xì)胞和支架材料復(fù)合培養(yǎng)，修復(fù)軟骨缺損已經(jīng)取得了初步成效。本課題研究的目的是采用軟骨組織工程技術(shù)，體外分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)培養(yǎng)、傳代后與軟骨細(xì)胞以7：3混合再與II型膠原支架材料和PLGA復(fù)合培養(yǎng)，觀察細(xì)胞在兩種支架材料上黏附、伸展和增殖情況，并觀察其在動物實驗中修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的情況。期望能夠找到軟骨組織工程理想支架材料與種子細(xì)胞。

3、 材料和方法 1．取3-4月齡健康新西蘭大白兔，穿刺抽取雙側(cè)脛骨上端骨髓6-8ml，Percoll分離法分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)行原代、傳代細(xì)胞培養(yǎng)。 2．取3月齡新西蘭白兔關(guān)節(jié)非負(fù)重區(qū)關(guān)節(jié)軟骨，將軟骨片剪成0.3cmxo.3cm大小，以0.2％的II型膠原酶消化8-10分鐘，離心、洗滌、計數(shù)。將細(xì)胞接種于50ml培養(yǎng)瓶中，加入10％胎牛血清培養(yǎng)液5ml，在37℃、5％CO<,2>、濕度飽和的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生

4、長接近融合后，以0.25％的胰酶消化收集備用。 3．取經(jīng)過培養(yǎng)6天的MSCs和軟骨細(xì)胞以7:3的比例混合，調(diào)整細(xì)胞濃度為4x10<'6>/ml，與PLGA、Ⅱ型膠原復(fù)合培養(yǎng)7天，進(jìn)行復(fù)合組織的病理形態(tài)學(xué)觀察；動物實驗備用。觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在PLGA、Ⅱ型膠原內(nèi)生長增殖情況。掃描電鏡觀察Ⅱ型膠原支架材料以及PLGA的結(jié)構(gòu)、孔隙率和細(xì)胞在支架內(nèi)的黏附和生長情況。 4．取3-4月齡健康新西蘭大白兔30只，在實驗兔的雙側(cè)股骨滑

5、車處鉆直徑4mm，深度4-5mm的骨軟骨缺損，深達(dá)軟骨下區(qū)。隨機分為2組：A組，15只，右膝軟骨缺損處植入混合細(xì)胞復(fù)合Ⅱ型膠原材料；B組，15只，右膝軟骨缺損處植入混合細(xì)胞復(fù)合PLGA材料；C組，空白對照組，為上述兩組的左膝軟骨缺損處，不植入任何材料。分別于術(shù)后4、8、12周各處死5只動物，進(jìn)行大體和組織學(xué)觀察。 結(jié)果 1．細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變 倒置相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，原代細(xì)胞接種后1-3日可見少量細(xì)胞貼壁，呈短梭形。3日后

6、出現(xiàn)細(xì)胞集落，7-8日廣泛集落形成。12-14同細(xì)胞形成單層。傳代細(xì)胞貼壁快，7-8日形成單層，細(xì)胞核大，胞漿內(nèi)顆粒多。 2．組織學(xué)觀察：細(xì)胞在Ⅱ型膠原支架中分布、生長良好。細(xì)胞外基質(zhì)豐富，可見細(xì)胞外基質(zhì)片狀形成，甲苯胺藍(lán)染色顯示細(xì)胞周圍異染性基質(zhì)。PLGA孔隙率差，復(fù)合的細(xì)胞較少。Ⅱ型膠原支架內(nèi)復(fù)合細(xì)胞的數(shù)量明顯高于PLGA支架。 電鏡觀察：掃描電鏡顯示Ⅱ型膠原纖維呈網(wǎng)架狀結(jié)構(gòu)，孔隙不規(guī)則，孔徑在100-200μ

7、m之間，孔壁厚度較均勻，為20-40μ m，孔隙率大于92％。復(fù)合材料顯示細(xì)胞在Ⅱ型膠原支架上的黏附、伸展和增殖良好，可以見到細(xì)胞分泌的基質(zhì)和細(xì)胞偽足的鉚固作用，表明支架材料具有良好的細(xì)胞親和性。 PLGA孔隙規(guī)則，表面光滑，孔徑在200-300μ m之間，孔壁厚度較均勻，為10-30 μ m，孔隙率約為82％，細(xì)胞黏附欠佳，水容性差，組織相容性不如Ⅱ型膠原纖原。 3．動物實驗結(jié)果 大體觀察：術(shù)后12周，

8、A組缺損修復(fù)區(qū)組織與周圍關(guān)節(jié)軟骨相整合良好，軟骨缺損區(qū)被光滑白色半透明的組織覆蓋，與周圍軟骨組織外形無差異；B組缺損區(qū)修復(fù)組織與周圍軟骨大部分整合，新生組織較軟，局部可見小的孔隙，光澤較差；C組缺損處修復(fù)組織低凹，新生組織軟，無光澤，與周圍軟骨組織區(qū)別明顯。 組織學(xué)觀察：術(shù)后12周，A組骨和軟骨組織增生活躍，新生軟骨與周圍軟骨融合較好，軟骨細(xì)胞排列整齊，鏡下所見修復(fù)軟骨與正常軟骨之間無明顯差別。B組缺損區(qū)主要由透明變性的纖維組織填充并

9、伸延至兩側(cè)關(guān)節(jié)軟骨表面，底部及邊緣可見少量骨組織和軟骨增生，鏡下形態(tài)與正常軟骨組織區(qū)別很大。C組缺損區(qū)內(nèi)主要為纖維組織。 結(jié)論： 1 軟骨細(xì)胞可分泌多種生長因子如：轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β、胰島素樣生長因子(IGF)等。這些因子是公認(rèn)的BMSCS軟骨分化誘導(dǎo)因子，軟骨細(xì)胞分泌的這些可溶性因子可能在BMSCs軟骨形成過程中發(fā)揮了重要作用。 2 BMSCs適合成為軟骨組織工程的種子細(xì)胞。取材方便，Percoll分

10、離法分離可以獲取大量骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，體外培養(yǎng)性能穩(wěn)定，易于傳代擴增，在與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)的誘導(dǎo)環(huán)境下，可以分化為軟骨細(xì)胞。 3 II型膠原是理想的軟骨組織工程支架材料。具有良好的孔隙率和組織相容性，BMSCs在其中可以很好地黏附、擴展和增殖。 4動物實驗研究中BMSCs與軟骨細(xì)胞復(fù)合II型膠原修復(fù)的軟骨缺損明顯優(yōu)于PLGA，與正常軟骨組織形態(tài)接近。表明BMSCs與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)復(fù)合的U型膠原材料是理想的軟骨組織