Ⅰ型膠原復(fù)合聚乳酸支架體外培養(yǎng)兔關(guān)節(jié)軟骨的實驗研究.pdf

1、關(guān)節(jié)軟骨損傷和缺損一直是骨科臨床治療的一個難題,一些方法：如骨膜移植、微骨折術(shù)、細(xì)胞移植、骨軟骨移植以及局部應(yīng)用成軟骨的生長因子等,都在一定程度上為這一難題的解決提供了可行方案,但又都有相應(yīng)的局限性。構(gòu)建組織工程人工軟骨的途徑來修復(fù)軟骨損傷被認(rèn)為是一種較理想的方法,但其發(fā)展也同樣面臨軟骨細(xì)胞增殖能力弱和去分化等問題的困擾。多數(shù)研究者采用種子細(xì)胞與單一的支架材料的方法構(gòu)建出組織工程軟骨,并在動物組織缺損修復(fù)的實驗中取得成功。這些成果證實了

2、組織工程技術(shù)的可行性和巨大的臨床應(yīng)用前景,但同時也表現(xiàn)出這種單一、簡單構(gòu)建方式的不足,其構(gòu)建的組織的體積、形態(tài)、生物學(xué)表現(xiàn)等與生理狀態(tài)下有極大的不同,不能滿足臨床應(yīng)用的實際需要。對此,采用與正常生理狀態(tài)類似的環(huán)境(生物環(huán)境、力學(xué)環(huán)境)進(jìn)行構(gòu)建是更為重要的領(lǐng)域。單一的人工材料支架如聚乳酸支架存在親水性、細(xì)胞粘附性差等缺點,I型膠原可以改善聚乳酸支架的親水性、細(xì)胞粘附性,且來源于胎牛皮膚的I型膠原對維持軟骨細(xì)胞表型,促進(jìn)其合成細(xì)胞外基質(zhì)具有

3、顯著的影響。研究復(fù)合材料支架對人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分化增殖的影響,體外培養(yǎng)具有更好的生物學(xué)性狀的組織工程軟骨以治療軟骨損傷具有重要的理論及現(xiàn)實意義。 目的： 1.探討解決軟骨細(xì)胞體外增殖過程中的去分化及增殖率下降問題。 2.研究I型膠原復(fù)合聚乳酸支架三維培養(yǎng)條件下關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖能力及表型穩(wěn)定性等生物學(xué)行為變化。 3.探討體外培養(yǎng)條件下軟骨細(xì)胞-支架復(fù)合物向軟骨組織轉(zhuǎn)化的可行性及有效途徑。 方法：

4、 1.軟骨細(xì)胞的來源：取四周齡新西蘭兔,超凈臺內(nèi)無菌條件下片狀切取雙肩、雙膝、雙髖關(guān)節(jié)軟骨,用機(jī)械和酶消化法獲得單個軟骨細(xì)胞,制成細(xì)胞懸液。 2.軟骨細(xì)胞的體外單層及三維培養(yǎng)：首先對取得的兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞行單層培養(yǎng)。取第二、三代單層培養(yǎng)細(xì)胞分別轉(zhuǎn)入聚乳酸、Ⅰ型膠原復(fù)合聚乳酸支架三維培養(yǎng)體系。 3.三維培養(yǎng)下軟骨細(xì)胞增殖情況的檢測:A)采用細(xì)胞計數(shù)法分別測定兩種支架培養(yǎng)體系中軟骨細(xì)胞增殖情況。B)繪制細(xì)胞生長曲線,以研究各實驗組在

5、短期內(nèi)的細(xì)胞增殖情況的差異。 4. 軟骨細(xì)胞的鑒定：采用HE染色及顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),對軟骨細(xì)胞特異性分泌產(chǎn)物Ⅱ型膠原的免疫組化、AB-PAS染色觀察,鑒定軟骨細(xì)胞來源,用改進(jìn)的二甲基亞甲藍(lán)(DMB)比色法測定細(xì)胞外基質(zhì)的糖胺多糖含量。 結(jié)果： 1、在一定培養(yǎng)條件下,兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞經(jīng)單層傳代培養(yǎng)擴(kuò)增,可在短時間內(nèi)獲得多量、性狀穩(wěn)定的軟骨細(xì)胞,第2、3代和原代軟骨細(xì)胞形態(tài)相近,并可分泌基質(zhì)膠原和蛋白多糖。第4代開

6、始出現(xiàn)去分化現(xiàn)象,第5代后軟骨細(xì)胞出現(xiàn)較嚴(yán)重去分化現(xiàn)象,第7代基本停止生長。 2.聚乳酸支架載體具有網(wǎng)眼狀孔隙結(jié)構(gòu),孔隙直徑為120～180um,軟骨細(xì)胞可結(jié)合于載體的網(wǎng)狀孔隙內(nèi)并呈團(tuán)簇狀生長。 3.三維培養(yǎng)條件下軟骨細(xì)胞增殖成團(tuán)簇狀,Ⅰ型膠原復(fù)合聚乳酸支架組的細(xì)胞計數(shù)水平及細(xì)胞集落高于單一聚乳酸支架組；復(fù)合支架組的糖胺多糖含量高于單-聚乳酸支架組。 4.聚乳酸支架組培養(yǎng)第5代時,部分組織切片Ⅱ型膠原免疫組化檢測

7、呈陰性；第8代時,組織切片Ⅱ型膠原免疫組化檢測呈陰性；Ⅰ型膠原復(fù)合聚乳酸支架組的第8代軟骨細(xì)胞特異性Ⅱ型膠原仍呈強(qiáng)陽性表達(dá),HE染色顯示細(xì)胞形態(tài)為圓形,培養(yǎng)細(xì)胞保持了良好的分化表型。 結(jié)論： 1.關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的單層培養(yǎng)擴(kuò)增可為組織工程研究提供足量的、生物學(xué)性狀良好的種子細(xì)胞。 2.聚乳酸支架載體初步具備作為軟骨細(xì)胞載體的條件,可用于軟骨組織工程的研究。 3.I型膠原對維持軟骨細(xì)胞表型,并促進(jìn)其合成細(xì)胞外基