體外構(gòu)建組織工程學(xué)骨-軟骨復(fù)合組織修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的研究.pdf

1、目的:利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)體外培養(yǎng)、增殖、誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞,移植于同種異體骨制備的“雙向”骨基質(zhì)明膠(BMG)上,構(gòu)建組織工程學(xué)骨/軟骨復(fù)合物,探討其修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的可行性及效果。
　　 方法:2-3月齡日本大耳兔36只,體重2.5-3.5kg,雌雄不限。
　　 體外實(shí)驗(yàn):①骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的提取、誘導(dǎo):取30只實(shí)驗(yàn)兔,無菌條件下骨髓穿刺針取股骨骨髓,采用密度梯度離心法和貼壁篩選法分離純化骨髓間充

2、質(zhì)干細(xì)胞,在特定的軟骨誘導(dǎo)劑(HG-DMEM、地塞米松0.1μmol/L,維生素C50mg/L,TGF-β110ng/L,ITS-31461％)、成骨誘導(dǎo)劑(15%FBS、LG-DMEM、地塞米松0.1μmol/L,維生素C50mg/L,β-甘油磷酸鈉10mmol/L)的定向誘導(dǎo)下,向軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化。②支架載體:取實(shí)驗(yàn)兔6只,處死后取股骨內(nèi)外髁及脛骨上端骨柱,制備一側(cè)全脫鈣,一側(cè)未脫鈣的"雙相"骨基質(zhì)明膠支架載體。③骨/軟骨復(fù)合

3、物的制備:將誘導(dǎo)后具有成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞相應(yīng)表型的MSC分別移植到事先處理好的"雙相"骨基質(zhì)明膠支架載體上,脫鈣側(cè)移植軟骨細(xì)胞;未脫鈣側(cè)移植成骨細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng),分別在1w,2w,3w行甲苯胺藍(lán)染色、茜素紅染色、堿性磷酸酶(ALP)染色,Ⅱ型膠原蛋白免疫組化染色。
　　 體內(nèi)實(shí)驗(yàn):骨/軟骨復(fù)合物的動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)、檢測:將抽取骨髓的30只實(shí)驗(yàn)兔,制成雙側(cè)股骨膝關(guān)節(jié)面骨/軟骨缺損模型,左右雙膝共4個(gè)缺損,單側(cè)關(guān)節(jié)面共上下兩個(gè)相同缺損。實(shí)驗(yàn)

4、兔右膝:將造模時(shí)取出的左膝自體骨/軟骨組織植入實(shí)驗(yàn)兔的股骨髕后上端軟骨缺損(A組),制備的自體MSC組織工程骨/軟骨復(fù)合物植入右側(cè)下端缺損(B組):左膝上端缺損植入空白支架(C組),下端缺損不予處理(D組:對照組);分別于術(shù)后4、8和12周取材,行大體觀察:茜素紅染色、甲苯胺藍(lán)染色:免疫組化檢測:堿性磷酸酶(ALP)染色、Ⅱ型膠原蛋白免疫組化染色。改良Wakitani法評分,比較各組修復(fù)效果差異。
　　 統(tǒng)計(jì)方法:采用SPSS1

5、1.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用方差分析,P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:體外實(shí)驗(yàn):通過茜素紅染色、甲苯胺藍(lán)染色、堿性磷酸酶(ALP)染色、Ⅱ型膠原蛋白免疫組化染色證實(shí),MSC作為種子細(xì)胞,可以分化成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞。經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色顯示,分化誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞在支架上可以成活及增殖;Ⅱ型膠原蛋白免疫組化染色顯示,支架一端細(xì)胞核藍(lán)染,另一端棕褐色,說明成功構(gòu)建骨/軟骨復(fù)合組織。

6、>　　 體內(nèi)實(shí)驗(yàn):大體觀察及茜素紅染色、甲苯胺藍(lán)染色、堿性磷酸酶(ALP)染色、Ⅱ型膠原蛋白免疫組化染色檢測顯示:A組:術(shù)后4w基本完全修復(fù),與周圍組織無明顯界限,按壓修復(fù)組織彈性好12w完全修復(fù)缺損,與周圍組織很難區(qū)分。B組:術(shù)后4w軟骨缺損基本修復(fù),表面光滑,有彈性;12w按壓缺損部位彈性類似正常關(guān)節(jié)軟骨,表面光滑,色澤基本一致,無明顯界限,與A組無明顯區(qū)別。C組:術(shù)后4w可見損處新生組織表面不規(guī)則,與周圍軟骨界限明顯,鑷子按壓時(shí)

7、略有彈性,但弱于正常關(guān)節(jié)軟骨;12w可見缺損處光滑,按壓有彈性,與周圍組織彈性有差別,顏色不一致,略凹陷。D組:未能修復(fù),關(guān)節(jié)軟骨缺損低于周圍軟骨組織,未見軟骨樣組織,按壓較硬,無彈性。
　　 改良Wakitani法評分結(jié)果顯示,在各時(shí)間段的檢測,A組、B組各項(xiàng)評分結(jié)果,優(yōu)于C組、D組,P＜0.01有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Ⅱ型膠原蛋白免疫組化染色結(jié)果顯示,A組、B組修復(fù)組織中的軟骨細(xì)胞陽性率明顯高于C組、D組,P＜0.01有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。<