組織工程骨-軟骨復(fù)合組織的構(gòu)建及體內(nèi)外形態(tài)學(xué)觀察的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、骨-軟骨復(fù)合組織多數(shù)存在于運(yùn)動(dòng)關(guān)節(jié)處，其發(fā)生、發(fā)育是在非常復(fù)雜的生物信號(hào)調(diào)控下完成的。一旦發(fā)育完成其將會(huì)保持相對(duì)恒定的解剖形態(tài)并發(fā)揮穩(wěn)定的功能，同時(shí)也就失去了再生功能，但會(huì)發(fā)生微小的生理性組織改建以滿足功能需要。此外，如果在發(fā)育過程中受到外來因素的影響，這一復(fù)雜組織的形成就會(huì)受到阻礙，導(dǎo)致發(fā)育不全甚至發(fā)育停止。這就提示我們，如果關(guān)節(jié)組織發(fā)生了損傷尤其是大面積缺損，由于其缺乏再生能力，僅依靠機(jī)體自身難以恢復(fù)。目前，現(xiàn)有的醫(yī)療技術(shù)還無法對(duì)這

2、類疾病進(jìn)行非常有效的治療。
　　本研究的目的就是利用組織工程技術(shù)尋找一種科學(xué)的方法，在體外模擬骨-軟骨形成的條件，構(gòu)建出具有生物活性的組織工程骨-軟骨復(fù)合組織，用于修復(fù)關(guān)節(jié)缺損從而恢復(fù)其外形與功能。本研究通過對(duì)種子細(xì)胞、支架的篩選，選擇出適宜的種子細(xì)胞與支架，然后構(gòu)建出具有解剖形態(tài)的復(fù)合組織，并進(jìn)行體內(nèi)移植的初步探索?；谶@一目的我們主要進(jìn)行了以下幾方面的研究。
　　一、組織工程骨-軟骨復(fù)合組織種子細(xì)胞的篩選
　　1.

3、軟骨細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的獲取及分離培養(yǎng)以2W齡新西蘭大白兔的耳軟骨、關(guān)節(jié)軟骨和骨髓為組織來源，采用組織塊酶消化法和全骨髓貼壁法進(jìn)行不同細(xì)胞的分離培養(yǎng)、增殖與純化。同時(shí)采用高密度和低密度細(xì)胞培養(yǎng)方式，對(duì)原代及第三代細(xì)胞的增殖能力、細(xì)胞表型、細(xì)胞分泌功能等生物學(xué)特性進(jìn)行分析。結(jié)果表明高密度培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞尤其是純化的原代細(xì)胞具有良好的生物學(xué)性能，具有較強(qiáng)的增殖及分泌細(xì)胞外基質(zhì)的能力。而且耳軟骨及關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)中沒有表現(xiàn)出明顯的生物學(xué)差

4、別，為利用不同部位軟骨細(xì)胞并獲得大量原代細(xì)胞提供了依據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)提示，采用貼壁篩選法進(jìn)行骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的擴(kuò)增純化可提供大量純化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞
　　2.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化為了進(jìn)一步篩選適宜的種子細(xì)胞，分別采用細(xì)胞非接觸式共培養(yǎng)誘導(dǎo)方式、條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)方式對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)。結(jié)果顯示不論采用何種誘導(dǎo)方式均可以將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為所希望的細(xì)胞，通過MTT、細(xì)胞周期、糖胺多糖分泌能力、堿性磷酸酶活性以

5、及細(xì)胞染色等檢測手段都證實(shí)誘導(dǎo)后的細(xì)胞具有良好的增殖分化能力，證實(shí)所培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有干細(xì)胞的特性。
　　通過對(duì)結(jié)果的進(jìn)一步分析可以看出，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化后，共培養(yǎng)誘導(dǎo)的細(xì)胞其各項(xiàng)生物學(xué)特性似乎要優(yōu)于條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)的細(xì)胞，這可能與軟骨細(xì)胞分泌更多的細(xì)胞因子和基質(zhì)有關(guān)，但與原代軟骨細(xì)胞相比其細(xì)胞狀態(tài)及分泌功能等還有一定差距。而向成骨方向誘導(dǎo)則取得了明確的結(jié)果，其成骨能力是肯定的，同時(shí)在對(duì)照組可以觀察到骨髓間充質(zhì)

6、干細(xì)胞本身就具有成骨趨勢，這可能與其來源于骨髓有關(guān)。因此，為了對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生盡量少的干擾因素，最終確定將原代軟骨細(xì)胞和成骨誘導(dǎo)的第三代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞。
　　二、組織工程骨-軟骨復(fù)合組織支架的篩選
　　1.構(gòu)建骨-軟骨復(fù)合組織支架的形態(tài)學(xué)和物理性能檢測選用4組多孔支架，分別進(jìn)行表面形態(tài)學(xué)、力學(xué)性能、體外降解等相關(guān)檢測，結(jié)果表明四組支架中明膠-硫酸軟骨素-透明質(zhì)酸鈉與明膠-陶瓷化骨支架基本符合實(shí)驗(yàn)要求，并最終選定為

7、復(fù)合組織的支架。
　　2.組織工程骨-軟骨復(fù)合組織的體外構(gòu)建及生物學(xué)性能為了觀察支架與種子細(xì)胞間生物相容性以及能否促進(jìn)細(xì)胞增殖分化等性能，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了支架復(fù)合細(xì)胞的研究。此外為了增強(qiáng)細(xì)胞在三維培養(yǎng)條件下增殖分化能力，還在支架內(nèi)復(fù)合了生長因子控釋系統(tǒng)，同時(shí)將支架構(gòu)建為含有雙層結(jié)構(gòu)的整體支架，分別在成骨與非成骨誘導(dǎo)條件下觀察體外組織工程骨-軟骨復(fù)合組織的形成情況。結(jié)果表明采用含有雙層結(jié)構(gòu)的整體支架分層復(fù)合兩種細(xì)胞能夠在成骨誘導(dǎo)條件下形

8、成較為理想的組織工程骨-軟骨復(fù)合組織。
　　三、組織工程骨-軟骨復(fù)合組織的構(gòu)建及體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)
　　1.組織工程骨-軟骨復(fù)合組織體內(nèi)異位移植采用熒光小鼠肋軟骨細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為種子細(xì)胞，參照前期實(shí)驗(yàn)方法與整體雙層支架復(fù)合，并在復(fù)合后第1、7、14d植入裸鼠皮下。觀察其體內(nèi)異位形成組織情況。經(jīng)過8W的連續(xù)觀察可以發(fā)現(xiàn)移植組織逐漸形成與天然組織類似的骨-軟骨結(jié)構(gòu)，而且通過熒光觀察新形成的組織系來自植入的復(fù)合組織。通過對(duì)實(shí)驗(yàn)各

9、組的比較觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞與支架復(fù)合后早期植入體內(nèi)更有助于組織的成熟，這可能與體內(nèi)環(huán)境含有更多的營養(yǎng)成分以及復(fù)合組織允許血管結(jié)構(gòu)的早期長入有關(guān)。
　　2.組織工程骨-軟骨復(fù)合組織修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)大部分缺損的實(shí)驗(yàn)研究為了探討具有解剖外形的骨-軟骨復(fù)合組織修復(fù)關(guān)節(jié)大部分缺損的能力。實(shí)驗(yàn)利用灌注快速成形技術(shù)并復(fù)合生長因子控釋系統(tǒng)構(gòu)建出具有三維解剖形態(tài)的骨-軟骨復(fù)合組織，然后進(jìn)行自體原位移植。通過術(shù)后24W連續(xù)觀察及相關(guān)檢測，觀察到在體內(nèi)關(guān)節(jié)微環(huán)境