大鼠BMSCs成骨誘導(dǎo)及復(fù)合支架構(gòu)建組織工程骨的研究.pdf

1、目的：
　　本研究以納米羥基磷灰石、膠原蛋白、絲素蛋白為原料制備仿生骨組織工程三維支架，并評價支架材料的孔隙率、孔徑大小、吸水率及生物力學(xué)性能。提取Wistar大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并成骨方向誘導(dǎo)，檢測細(xì)胞形態(tài)變化、堿性磷酸酶染色、鈣結(jié)節(jié)染色及I型膠原和骨鈣素表達(dá)鑒定成骨誘導(dǎo)活性。將成骨方向誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與制備支架復(fù)合培養(yǎng)以檢測其細(xì)胞生物相容性及構(gòu)建組織工程化骨的可行性。
　　方法：
　　1.三維支架材料的制備：

2、冷凍干燥法制備納米羥基磷灰石、膠原蛋白、絲素蛋白(Nano-HA、COL、SF)質(zhì)量比分別為1：1：5（A組）、1：2：5（B組）及1：3：5（C組）三組復(fù)合支架。改良液體位移法測定支架孔隙率；質(zhì)量差值法測量吸水膨脹率；Instron5865力學(xué)試驗機測定力學(xué)性能；掃描電鏡（SEM）觀察支架內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)。
　　2.大鼠BMSCs細(xì)胞的提取及培養(yǎng)：脫頸法處死Wistar大鼠，無菌條件下提取股骨、脛骨內(nèi)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，以10％胎牛血

3、清的DMEM/F12培養(yǎng)基原代培養(yǎng)，并傳代，傳至第3代，待用。
　　3. BMSCs細(xì)胞成骨方向誘導(dǎo)干預(yù)及分組：取生長良好的第3代BMSCs細(xì)胞，按1×105L-1的細(xì)胞濃度接種于無菌24孔板內(nèi)，分為實驗組與對照組2組；每組12孔，每組再各分4個亞組，需要染色的組別預(yù)先在孔內(nèi)放入經(jīng)滅菌處理的蓋玻片。分別對各相應(yīng)組內(nèi)細(xì)胞作堿性磷酸酶（ALP）染色，鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色，以及I型膠原和骨鈣素表達(dá)的檢測。干預(yù)措施為：實驗組以含成骨誘導(dǎo)劑的D

4、MEM/F12完全培養(yǎng)液培養(yǎng)；對照組則僅用含胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。各組均每3天換細(xì)胞培養(yǎng)液1次，換液量相等。
　　4.成骨誘導(dǎo)后的細(xì)胞接種于三維支架復(fù)合培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)后的第2、4、6、8、12d做MTT細(xì)胞活性檢測；另外取培養(yǎng)第8d的復(fù)合培養(yǎng)物作掃描電鏡觀察以及組織HE切片染色。
　　結(jié)果：
　　1.三組支架材料均為三維多孔結(jié)構(gòu)，具有一定的孔徑及孔隙率。B組支架更符合要求：孔徑98~260μm，平

5、均孔徑為177μm；孔隙率為(96.72±2.78)%；吸水膨脹率為(549.37±35.29)%；生物力學(xué)試驗機測定其力學(xué)性能穩(wěn)定、壓縮應(yīng)變以及彈性模量等指標(biāo)適宜骨組織工程研究應(yīng)用。
　　2.提取BMSCs細(xì)胞及誘導(dǎo)培養(yǎng)：提取的BMSCs原代細(xì)胞為單個核細(xì)胞，形態(tài)大部分為球形，25cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)體外培養(yǎng)1~3天后，可見細(xì)胞呈橢圓形、球形貼壁生長。繼續(xù)培養(yǎng)后，圓形貼壁細(xì)胞的數(shù)量明顯減少。培養(yǎng)5~7天后，形態(tài)以梭形為主。成骨誘導(dǎo)第2

6、~3天后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，由梭形變?yōu)槎嘟切危?天時以多角形為主。ALP染色可見多個胞質(zhì)內(nèi)、細(xì)胞核內(nèi)染色均呈陽性表現(xiàn)。培養(yǎng)21天后作細(xì)胞爬片的茜素紅染色鈣結(jié)節(jié)，可見細(xì)胞染色呈深紅色或橘紅色的鈣鹽沉積，細(xì)胞與細(xì)胞之間呈團(tuán)塊狀。結(jié)節(jié)團(tuán)塊的大小及形態(tài)不一，數(shù)個或多個礦化結(jié)節(jié)可融合成塊。經(jīng)檢測I型膠原和骨鈣素表達(dá)均呈陽性。
　　3.誘導(dǎo)細(xì)胞與支架復(fù)合培養(yǎng)后掃描電鏡及 HE切片染色結(jié)果顯示，支架內(nèi)有大量細(xì)胞長入，生長狀態(tài)良好，完全伸展。支架內(nèi)

7、部結(jié)構(gòu)被一層細(xì)胞基質(zhì)覆蓋，孔與孔之間有細(xì)胞長入。MTT檢測結(jié)果為細(xì)胞在一定時間內(nèi)呈對數(shù)生長。
　　結(jié)論：
　　1.三組支架均為三維多孔結(jié)構(gòu)，B組支架在孔徑大小、孔隙率及力學(xué)性能等方面更適用于骨組織工程需求。
　　2.經(jīng)檢測ALP、鈣結(jié)節(jié)及骨鈣素等指標(biāo)驗證所得細(xì)胞為成骨活性細(xì)胞，同時反向驗證提取細(xì)胞為BMSCs,可用于構(gòu)建骨組織工程化骨組織。
　　3.細(xì)胞/支架復(fù)合培養(yǎng)后，細(xì)胞在支架內(nèi)部生長良好，且分泌細(xì)胞外基質(zhì)。