nHA涂層BCP多孔陶瓷構建骨組織工程支架的實驗研究.pdf

1、目的：觀察納米羥基磷灰石(nano-hydroxyapatite，nHA)涂層是否可以增強雙向磷酸鈣（biphasic calcium phosphate，BCP）陶瓷支架的成骨誘導能力。
　　方法：(1)使用水熱沉積法對傳統(tǒng)BCP進行nHA涂層構建新型陶瓷支架，通過掃描電鏡（field emission scanning electronmicroscopy, FESEM）、透射電鏡(field emission transmi

2、ssion electronmicroscopy, FETEM)、X線衍射儀(X-ray diffraction，XRD)對支架進行形貌表征及相組成分析，并對涂層對BCP支架的物理及力學性能的影響進行研究;(2)采用體外細胞毒性試驗及溶血試驗評估材料的生物相容性;(3)應用密度梯度離心聯(lián)合貼壁篩選的方法，體外分離培養(yǎng)兔骨髓來源的間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，培養(yǎng)過程中倒置顯微鏡下觀察其生物學特性

3、，流式細胞儀檢測細胞表型，所得的細胞進行成骨誘導分化后進行堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)染色及茜素紅染色鑒定。將MSCs與支架進行共培養(yǎng)并誘導成骨分化，研究nHA涂層對MSCs的增殖、活力及成骨分化的影響;(4)取20只健康新西蘭兔，所有動物均建立雙側橈骨1.5cm的骨缺損模型。采用完全隨機法將40側前肢隨機分為A、B、C、D四組，每組10側。其中A組為對照組，B、C、D三組為實驗組。A組在骨缺損處植入BC

4、P、B組植入nHA涂層BCP、C組植入種植了MSCs的BCP、D組植入種植了MSCs的nHA涂層BCP。術后12周取標本進行觀察，通過X線片、生物力學測定、組織學及免疫組化等觀察各組支架的骨修復能力。
　　結果：(1)水熱沉積法可以合成棒狀形貌nHA晶體，F(xiàn)ETEM測量顯示合成的單個nHA晶體長度約為50nm～200 nm，直徑約為15mm～30 mm。XRD顯示在BCP表面形成了羥基磷灰石的沉積層。FESEM顯示在BCP表面形成

5、了nHA沉積層。nHA涂層對BCP陶瓷的密度、孔隙度、壓縮強度及抗彎強度無明顯影響（P＞0.1）;(2)體外細胞毒性顯示兩種受試材料在不同的時間點，細胞毒性等級測定結果均為0級。BCP原液組的溶血率(Hemolysis rate，HR)為3.70％，nHA涂層BCP原液組的HR為3.56％;(3)原代分離培養(yǎng)的貼壁細胞呈長梭形，漩渦狀排列。傳代后增殖迅速，細胞為單一的梭形，排列更加有序。培養(yǎng)的細胞CD44呈陽性表達，而CD34呈陰性表達

6、。成骨誘導后ALP染色和茜素紅染色均呈陽性。細胞與支架共培養(yǎng)第1天，BCP組與nHA涂層BCP組的細胞密度依次為62±26個/mm2與63±27個/mm2(P＞0.1)。第14天BCP組與nHA涂層BCP組的細胞密度依次為415±62個/mm2與541±35個/mm2(p＜0.05)。MTT檢測結果顯示BCP組的細胞活力明顯低于nHA涂層BCP組(P＜0.05)。另外，nHA涂層BCP組ALP活性、Ⅰ型膠原濃度及骨鈣素濃度明顯高于BCP

7、組(P＜0.05);(4)X線片示:A組骨缺損得到基本修復。B組、C組及D組骨缺損得到完全修復。各組最大彎曲載荷測試結果比較:A組明顯小于B組(P＜0.05），B組明顯小于C組(P＜0.05），C組明顯小于D組(P＜0.05）。組織形態(tài)學顯示各組支架周圍均可形成以成熟骨組織為主的新生骨痂，并長入支架孔隙內(nèi)。支架孔隙內(nèi)新骨形成百分率A組明顯小于B組(P＜0.05），B組明顯小于C組(P＜0.05)，C組明顯小于D組（P＜0.05）。免疫組

8、化染色結果顯示BMP-2在D組的陽性表達最高，其次為C組，B組次之，A組最少，各組之間兩兩比較有顯著性差異（P＜0.05）.
　　結論：(1)水熱沉積法可在BCP表面形成棒狀的nHA沉積層，nHA涂層不會明顯影響B(tài)CP陶瓷的密度、孔隙度、彎曲強度及壓縮強度;(2) BCP與nHA涂層BCP多孔陶瓷無細胞毒性，也不引起溶血反應，具有良好的生物相容性;(3)本研究率先將兔骨髓來源的MSCs接種到nHA涂層BCP多孔支架上并誘導分化為成